“杀敌一千，自损八百”可被破局了！黄芪皂苷III可调节环磷酰胺所诱导的免疫抑制

环磷酰胺（CTX）是一种细胞毒性药物，在临床上多用于治疗恶性肿瘤，具有较强的免疫抑制作用，但其产物磷酰胺氮芥对肿瘤细胞和正常细胞的选择性不高，在杀伤肿瘤细胞的同时，机体的正常细胞也死伤惨重，进而导致严重的免疫抑制，故而寻找一种合适的药物以缓解CTX所造成的免疫抑制极为重要。

黄芪皂苷III（AS-III）是从中药黄芪中提取的一种高浓度小分子，作为黄芪的单体成分，具有增强机体免疫力，抗病毒及抗炎的作用。有研究表明AS-III可以缓解CTX所致的免疫抑制，但具体作用机制并不明晰。

近日，一篇发表于《Journal of Ethnopharmacology》的论文“Exploration of the underlying mechanism of Astragaloside III in attenuating immunosuppression via network pharmacology and vitro/vivo pharmacological validation”通过网络药理学结合体内体外实验对这一机制进行了探究。

网络药理学手段揭示AS-III抗免疫抑制的机制

研究者将筛选的AS-III靶点和免疫抑制相关靶点导入Venny，获得105个共同靶点，即为AS-III抗免疫抑制的潜在靶点。紧接着对潜在作用靶点进行GO功能和KEGG富集分析，并绘制“疾

病-药物-通路-靶点”网络图，发现潜在靶点主要涉及肿瘤中心碳代谢与HIF-1信号通路等。进一步将交集靶点通过STRING平台建立PPI网络，筛选出AS-III抗免疫抑制的核心靶点，并利用AutoDock软件对核心靶点进行分子对接，发现AS-III与LDHA、AKT1和HIF1A等具有较好的结合活性。

图1 网络药理学手段揭示AS-III抗免疫抑制的机制

图2 分子对接

AS-III抗免疫抑制的体内研究

研究者选择6-8周龄的雄性C57小鼠，适应性喂养后随机分为空白对照组、模型组、LH组（40mg/kg）、AS-III高剂量组（80mg/kg）、AS-III中剂量组（40mg/kg）以及AS-III低剂量组（20mg/kg），每组10只。依据小鼠体重给予LH组和AS-III组相应的药物灌胃，空白对照组与模型组给予等量的生理盐水，每日1次，连续9天。另外，在第4-6天时，除空白对照组以外的其余各组小鼠腹腔注射CTX（80mg/kg）以构建免疫抑制动物模型。

结果显示，模型组小鼠的体重呈明显下降趋势，而LH组和AS-III治疗组则可以缓解这一趋势。此外，与模型组相比，AS-III高剂量组和中剂量组胸腺指数和脾脏指数显著增加，这提示灌胃AS-III可以促进免疫力低下小鼠免疫器官的恢复和发育，高剂量组效果最佳。

图3 AS-III对免疫抑制小鼠体重和胸腺、脾指数的影响

研究者又对各组织病理的变化进行观察发现脾脏空白对照组的白髓和红髓分布均匀，而模型组红髓偏多，细胞排列不紧密且出现空泡状。与模型组相比，AS-II治疗组白髓显著增多，分布均匀，这提示组织内淋巴细胞增多。

图4 AS-III对免疫抑制小鼠器官组织病理的影响

研究者还对小鼠的血细胞进行了测定发现，与空白对照组相比，模型组小鼠白细胞数、红细胞数、血小板均显著降低；与模型组相比，LH组和AS-III高剂量组的白细胞、红细胞、血小板数量均显著升高，这提示AS-III可能通过上调免疫功能低下小鼠的血细胞来增强细胞免疫。

图5 AS-III对免疫抑制小鼠血液学的影响

研究者利用Western blot技术测定脾脏和骨髓中HIF-1α/PDHK-1信号通路的蛋白表达，结果显示，相较于对照组，模型组中HIF-1α、PDHK-1和LDH的蛋白表达显著增高，而AS-III的治疗则很好的逆转了这一现象。

图6 AS-III对HIF-1α/PDHK-1信号通路的影响

研究者又继续检测了血清中的细胞因子水平发现，模型组中PDHK-1、LDH、乳酸、PK、HK、GLUT-1和ATP的表达增加，TNF-α和IL-1β的表达减少；而AS-III治疗组逆转了这一现象的发生。这提示AS-III可通过抑制炎症反应，缓解CTX引起免疫抑制。

图7 ELISA测定血清中的细胞因子水平

AS-III抗免疫抑制的体外验证

研究者使用缺氧或脂多糖诱导构建RAW264.7巨噬细胞模型，进一步实验发现，AS-III可通过促进巨噬细胞的迁移、吞噬和黏附而增强其免疫功能。

图8 MTT法检测细胞活性

图9 AS-III可增强巨噬细胞的免疫活性

吸取细胞培养液上清检测NO、 PDHK-1、 TNF-α、 IL-1β、 LDH、 乳酸、 PK、 HK、 GLUT-1和ATP的表达情况，结果显示，AS-III可显著降低PDHK-1、LDH、NO、TNF-α、IL-1β、乳酸、HK、PK和GLUT-1的水平，上调ATP的水平。

图10 AS-III对巨噬细胞所产生的细胞因子的作用

研究者又使用western blot技术对HIF-1α/PDHK-1信号通路上的蛋白进行检测发现，与体内结果一致，AS-III可以影响HIF-1α/PDHK-1信号通路上关键蛋白的表达。

图11 AS-III影响 HIF-1α/PDHK-1信号通路

研究者进一步使用HIF-1α抑制剂YC-1、PDHK-1抑制剂DCA和HIF-1α激动剂DMOG证实，AS-Ⅲ可以抑制缺氧和内毒素条件下HIF-1α、PDHK-1和LDH水平的上调。

图12 HIF-1α、PDHK-1和LDH的表达情况检测

在此研究中，研究者初步分析了AS-III抗免疫抑制的主要靶点，并通过体内外实验明确主要作用机制：AS-III通过HIF-1α/PDHK-1信号通路调节免疫减弱免疫。这为AS-III小分子药物的开发提供了较好的实验基础。

参考文献：

Yining He, Heba M. Amer, Zonghui Xu, et al. Exploration of the underlying mechanism of Astragaloside III in attenuating immunosuppression via network pharmacology and vitro/vivo pharmacological validation,Journal of Ethnopharmacology,2024,118235.