Cell：单细胞测序+蛋白质组成像，绘制迄今最全面的空间分辨健康人类骨髓图谱

骨髓是一个复杂的器官，容纳了来自造血、间充质、内皮、血管平滑肌和神经谱系的各种细胞，对造血过程至关重要。其中，许多非造血细胞，包括内皮细胞（EC）、间充质干细胞（MSC）和成骨细胞，是骨髓生态位（niche）的关键组成部分。

非造血细胞在骨髓细胞总量占比<0.5%，受限于分离技术，定义骨髓微环境的单细胞组成受到挑战。此外，特定的细胞分离方法也可能极大地影响捕获的细胞类型多样性，如骨髓抽吸，其无法捕获紧密粘附在骨表面的细胞，并且可能使骨髓MSC成分偏向脂肪细胞。总体而言，目前大多数研究都缺乏生态位细胞的空间信息，并且尚不清楚是否存在具有不同空间组织的人类MSC亚型。

近日，美国宾夕法尼亚大学Tan Kai、秦聆团队合作在Cell上发表了题为“Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging”的文章。研究团队对29,325个非造血细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，发现了9种不同转录亚型；同时分析了53,417个造血细胞，预测其与非造血细胞亚型的相互作用；并通过索引共检测（CODEX）对超120万个细胞进行空间分析，整合CODEX数据与scRNA-seq数据，将预测的细胞信号与空间邻近性相关联。

该研究发现了多种非造血细胞亚型，揭示了人类骨髓中非造血细胞和造血细胞的重要性和相互作用，以及早期骨髓造血过程中特定细胞类型的空间分布。利用CODEX图谱对新图像进行注释，发现了急性髓系白血病（AML）患者样本中骨髓MSC扩增，以及白血病母细胞与MSC共同富集的空间邻域。综上，这一空间分辨的骨髓多组学图谱为研究人类骨髓细胞相互作用提供了参考。

文章发表在Cell

图1. 采用scRNA-seq和CODEX多重成像以阐明细胞和空间结构人骨髓微环境

主要研究内容

人类骨髓综合scRNA-seq图谱

为揭示人类骨髓的细胞组成，研究团队开发了利用酶从股骨头组织中释放细胞的实验流程，并设计了一种富集策略。通过从16名接受髋关节置换手术的个体中收集新鲜股骨头的骨髓，研究人员利用scRNA-seq和CODEX共分析了53,417个造血细胞和29,325个非造血细胞，构建了骨髓综合scRNA-seq图谱。经质量过滤后，每个细胞的中位数为16,903个唯一分子标识符（UMIs）、3,117个独特基因和约3%线粒体reads。

造血细胞分析发现了三系造血和HSPC亚群，并改进了其他以造血为中心的骨髓scRNA-seq数据，捕获了完整的粒细胞分化轨迹。非造血细胞分析鉴定了三种主要细胞系——血管平滑肌细胞 （VSMC）、EC和间充质细胞（包括MSCs和成骨细胞）。骨髓中这些细胞内的细胞多样性远高于现有scRNA-seq参考数据集。

图2. 人骨髓造血细胞和非造血细胞的单细胞转录组图谱

MSCs和ECs的转录多样性

MSCs细胞存在显著异质性，研究团队进一步确定了其可分为骨细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等不同类型。此外，研究还发现了多种在基因表达、细胞功能和分化能力上存在显著差异的独特MSCs亚群（图3），具有最高CXCL12水平和高表达脂肪系基因的Adipo-MSCs亚群；高表达脂肪系基因的THY1+ MSCs亚群，其具有独特的表达谱；以及Fibro-MSCs亚群，具有较高的成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）形成能力和分化能力，可表达MSCs标志物（即THY1、DPT、NES和NT5E等）。

研究发现了两类骨髓内皮细胞，即动脉内皮细胞（AEC）和静脉内皮细胞（SEC）。将多个已发表的健康人类MSCs scRNA-seq数据集映射到骨髓综合scRNA-seq图谱中，发现该图谱捕获了更多非Adipo-MSC亚群，以及THY1+ MSCs细胞和Fibro-MSCs细胞，这强调了捕获非造血细胞异质性的重要性。

综上，该研究发现了人类骨髓MSCs中存在先前未被描述、功能上具有影响的多样性，并证明了骨髓综合scRNA-seq图谱的实用性，可用于表征其他scRNA-seq数据集中MSCs的相似性和差异性。

图3. 人骨髓非造血细胞组成

MSCs、ECs和骨细胞协同产生多种造血支持因子

研究团队分析了MSC的异质性能否导致造血支持因子的转录差异（图4），发现不同MSC类型专门产生特定的支持因子，如CXCL12在Adipo-和THY1+ MSCs中表达最高，而IGF1主要在Fibro-MSCs中表达。

CellChat系统分析显示，成骨细胞和MSCs都可能维持HSPC，但大多数典型支持因子由MSCs亚群产生，尤其是Adipo-MSCs和THY1+MSCs；CD4+T细胞是骨髓中FLT3LG的主要生产者，其对骨髓形成十分重要。

图4 .造血细胞和非造血细胞类型之间的不同信号传导模式

人体骨髓生态位的原位解剖结构

为对scRNA-seq图谱中骨髓细胞类型进行单细胞定义，研究团队通过全玻片CODEX多重成像技术对12个样本进行成像，并设计验证了一个54-plex panel（53个抗体+ DAPI）（图5）。共识别出32种细胞类型，包括免疫表型HSC（Lin- CD34+ CD38- CD45RA- CD90+）和Schwann细胞等罕见细胞；个体之间的总体细胞类型分布相似。

CODEX细胞类型的蛋白质表达谱与scRNA-seq数据高度匹配，匹配的细胞类型得分非常高，最终细胞类型注释可用于“细胞表型图”中细胞拓扑结构可视化。该注释参考图是造血细胞在其微环境背景下的拓扑综合图谱，凸显了这两个图谱在了解人类骨髓细胞解剖学方面的互补性。

图5. 54-plex CODEX成像揭示了人类骨髓的空间细胞地形

随后，研究团队通过细胞邻域分析和CellChat预测了骨髓内的细胞组织和相互作用。结果显示，共识别出15个细胞邻域（CNs），混合谱系区域（CN7 和 CN8）HSPCs最多，CN4和CN6两个邻域富含GMP/成髓细胞和早期髓系祖细胞（EMP），其沿骨内表面和小动脉周围强烈定位。CellChat预测显示，成骨细胞-VSMC相互作用并共定位，形成动脉-骨内膜生态位。

HSPC的脂肪细胞周围定位

研究团队分析了6种关键微环境结构，包括脂肪细胞、小动脉、骨骼、巨噬细胞及其突起、窦状体和CXCL12+基质（图6）。结果显示，小动脉最接近骨骼；中心生态位以窦状体、脂肪细胞、基质和巨噬细胞为特征。有趣的是，所有MSCs细胞都靠近动脉-骨内膜生态位，但Adipo-MSC位于窦状体附近。

CODEX图谱显示，HSPCs接近巨噬细胞；GMP/髓母细胞以及EMPs接近脂肪细胞。相比之下，成熟的髓样细胞最接近血窦，而非小动脉或骨骼，揭示成熟过程发生在中央、血窦周围生态位，上述数据表明髓系发育受到空间限制。

图6. 骨髓微环境的综合结构分析揭示了谱系非特异性的脂肪细胞定位-固定HSPC

健康骨髓CODEX图谱在AML中的应用

研究团队以健康图谱为参考，使用骨髓CODEX panel探究了肿瘤进化和微环境的变化，分析了AML患者样本，发现AML患者的髓样细胞比例显著增加，出现非常明显的结构变化。邻域分析显示，AML样本中有4个blast富集的邻域——Dx- CN3 /CN5/CN9/CN12，其中两个邻域富集了MSC细胞群。进一步分析发现动脉-骨内膜早期髓系邻域可能在治疗抵抗中发挥作用。

图7. AML的无监督单细胞定位揭示基质扩增和MSC富集的AML特异性邻域

结 语

综上所述，研究团队报告了迄今为止最全面的健康人类骨髓参考图谱，涵盖了造血和非造血细胞类型及其空间组织，揭示了人类骨髓中显著的非造血多样性与原位离散的空间表型，展示了CODEX图谱在AML患者中的应用。该研究构建的人类骨髓多组学图谱将为未来人类骨髓生态位的研究提供重要参考。

论文原文：

Bandyopadhyay S, Duffy MP, Ahn KJ, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. Published online May 2, 2024. doi:10.1016/j.cell.2024.04.013

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00408-2