【J Transl Med】AML/MDS异基因移植后监测MRD，首次探索ddPCR联合MFC

移植后ddPCR监测

对于急性髓系白血病（AML）和高危骨髓增生异常综合征（MDS）患者，在诱导和巩固治疗或强化治疗(如异基因造血干细胞移植[allo-HSCT])后监测可测量残留疾病(MRD)是预测复发和生存的重要指标。目前有多种方法用于检测MRD，包括多参数流式细胞术(MFC)测定白血病相关免疫表型(LAIP)、实时qPCR (RT-qPCR)、二代测序(NGS)和微滴式数字PCR (ddPCR)。但检测MRD目前还没有统一方法，特别是在异基因造血干细胞移植后。

MFC技术广泛用于MRD检测以预测患者预后，但其准确性(检测深灵敏度为0.01%)有待提高，而ddPCR具有超高的灵敏度灵敏度可达0.001%)。因此，应用ddPCR监测MRD是跟踪疾病缓解、提供预后信息和指导临床决策的一个有吸引力的选择。但关于allo-HSCT后ddPCR-MRD监测可行性的研究较少，特别是同时针对多个分子标记的研究。

此外，年龄相关克隆性造血基因预测预后的能力有限，特别是DNMT3A、TET2和ASXL1突变(DTA)，DTA突变作为移植后MRD监测标志物的预后影响存在争议。

《Journal of Translational Medicine》近日发表一篇中国多中心回顾性研究，旨在评估通过ddPCR监测移植后MRD是否能准确区分高复发风险的AML/MDS患者，并确定异基因造血干细胞移植后DTA突变在AML/MDS中的预后作用。此外还首次使用ddPCR和MFC同时进行MRD分析，以确定联合检测是否可以提高预测准确性。文章共同通讯作者为浙江大学医学院附属第一医院赵妍敏教授、黄河教授和上海交通大学医学院附属瑞金医院胡晓霞教授。

研究结果

该回顾性研究纳入中国3家中心接受allo-HSCT的152例AML/MDS患者（图1），具体要求包括：在诊断时通过NGS或实时qPCR检测到至少一种髓系肿瘤相关突变或融合基因，用于移植后MRD监测；接受清髓性预处理方案；成功实现干细胞植入；在HSCT后+30天至+120天内接受至少一次ddPCR骨髓MRD检测。

通过MFC（灵敏度0.01%）和ddPCR检测MRD；对于前者，>20个细胞表达两个或多个LAIP标记物时为MRD阳性；对于后者，在10万个细胞中检测到1个以上遗传异常细胞(变异等位基因频率，VAF≥0.001%)为MRD阳性。

患者特征和临床结局

152例患者均具有至少一种分子标志物，并在allo-HSCT后120天内进行ddPCR-MRD检测；共525次ddPCR-MRD分析，平均每例患者进行4次分析。患者中位年龄为44岁(12-67)。原发病包括AML（83.6%，127/152)和MDS (16.4%，25/152)。DTA MRD阳性组和DTA MRD阴性组的基线特征无显著差异；在非DTA基因患者中，MRD阳性组DRI-R风险水平更高。详细的患者特征总结于表1。最终，29例患者(19.1%)在allo-HSCT后复发，中位至复发时间为8.1个月。8例(5.3%)患者死于非复发性疾病。

ddPCR的可追踪基因图谱及检测结果

有54个髓系肿瘤相关突变或融合基因作为 allo-HSCT 后可追踪的分子靶标，每例患者的中位分子靶标数量为2个。在152例患者中，诊断时最常检测到的基因为WT1(n=36)、NRAS(n=25)、FLT3-ITD(n=24)、NPM1(n=23)、DNMT3A(n=20)、CEBPA(n=18)、TET2,RUNX1-RUNX1T或IDH2(n=17)、TP53(n=13)、RUNX1(n=10)、IDH1,MLL-PTD或c-KIT(n=9)、BCOR或U2AF1(n=8)、CBFβ-MYH11或GATA2(n=7)、KRAS或ASXL1(n=6)、PTPN11, FLT3-TKD, EZH2, CSF3R, MLL-ELL或STAG2(n=5)。

58例(38.2%)患者在allo-HSCT后4个月内MRD呈阳性，中位VAF为0.198%。最常检测的移植后MRD+靶标为RUNX1-RUNX1T1 (n=11)、TET2 (n=10)、TP53 (n=6)、WT1 (n=5)、RUNX1或CBFβ-MYH11 (n=4)和NRAS\NPM1或U2AF1 (n=3)。此外，在频率≥5的靶标中，移植后MRD+ 检测率（移植后/诊断时）相对较高的基因包括RUNX1-RUNX1T1（检测率：65%）、TET2(58%)、CBFβ-MYH11(57%)、TP53(46%)、RUNX1(40%)、U2AF1(38%) 和ASXL1(33%)。

ddPCR-MRD的预后作用

中位随访23.1个月。通过竞争风险模型分析，allo-HSCT后MRD阳性患者的累积复发率（CIR）高于MRD阴性患者(33.5% vs.10.3%，P<0.001)，而两组的非复发死亡率（NRM）相似(6.7% vs. 4.4%，P=0.541)；此外MRD阳性患者的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）明显低于MRD阴性患者(RFS：59.8% vs. 83.8%，P<0.001；OS：64.3% vs. 91.0%，P<0.001)。

DTA和非DTA基因作为MRD标志物的预后影响

进一步分析了DTA和非DTA基因对预后的影响，以确定DTA突变是否适合作为预测异基因造血干细胞移植后预后的MRD标志物。总共40例患者至少有一个DTA突变，而150例患者至少有一个非DTA基因，然后将DTA和非DTA基因分开分组。在携带DTA基因的患者中，HSCT后MRD+的患者有13例(32.5%)，包括TET2突变10例、DNMT3A突变2例、ASXL1突变2例；而在非DTA基因组，allo-HSCT后MRD+的患者有52例(34.7%)。DTA MRD+组和DTA MRD-组之间，allo-HSCT后的CIR (23.1% vs. 14.8%，P=0.571)、RFS (69.2% vs. 81.5%，P=0.453)和OS (76.9% vs. 85.2%，P=0.537) 无统计学差异，提示DTA基因可能不具有预测作用，不适合作为移植后的监测指标。但在非DTA组，与MRD-患者相比，MRD+患者的CIR较高(38.7% vs. 9.7%，P<0.001)且RFS (55.5% vs. 83.7%，P<0.001)和OS (60.5% vs. 90.5%，P<0.001)较差(图2)。

单因素分析显示，非DTA基因患者的ddPCR-MRD+和高/极高危DRI-R与CIR升高、RFS降低和OS降低相关。allo-HSCT时≥CR2缓解状态与CIR升高和RFS降低相关，未CR与CIR和NRM风险增加以及较差的RFS和OS相关(表2)。在DTA基因患者中，单因素分析显示，没有显著的风险因素与临床结局相关。

多因素分析模型（表3，图3)显示，在非DTA基因患者中，ddPCR-MRD+是CIR (HR=4.02，P<0.001)、RFS (HR=2.92，P=0.002)和OS (HR=3.12，P=0.007) 的独立预后因素。此外，高危/极高危DRI-R与较高CIR (HR=3.39，P=0.006)、较差RFS (HR= 4.16，P=0.001)和较差OS (HR=4.00，P=0.008) 显著相关。

在浙江大学医学院附属第一医院内部验证和其他医院外部验证中，MRD阳性与较高CIR之间存在显著关联。

ddPCR和MFC联合评估对非DTA基因患者预后的影响

为了更准确地识别高复发风险患者，在非DTA基因患者中使用MFC和ddPCR对MRD检测进行联合评估。将患者分为四组：①MFC MRD阳性和非DTA MTD阳性(F+/M+，n=8)，②MFC MRD阴性和非DTA MRD阳性(F-/M+，n=43)，③MFC MRD阳性和非dta MRD阴性(F+/M-，n=6)，④MFC MRD阴性和非DTA MRD阴性(F-/M-，n=93)。

结果显示，与其他三组相比，F+/M+患者的CIR最高(F+/M+ 75.0% vs F+/M- 50.0% vs F-/M+ 32.9% vs F-/M- 6.9%，P<0.001)、RFS最差(25.0% vs 50.0% vs 60.1% vs 86.1%，P<0.001)、OS最差(57.1% vs 83.3% vs 60.4% vs 91.1%，P=0.004)，而F-/M-患者在复发、RFS和OS方面最佳(图4)。但四组之间的NRM没有差异。对联合评估、DRI-R和HSCT时缓解状态进行多因素分析，结果显示，与F-/M-组相比，F+/M+组(HR=22.44，P<0.001)、 F+/M-组(HR=12.46，P<0.001)、F-/M+组(HR=4.51，P=0.003)移植后复发的风险显著增加(图3；表4)。多因素分析显示，DRI-R水平仍具有统计学意义：DRI-R风险水平越高，CIR越高、RFS和OS越差。与单独任何一种技术相比，联合评估显示出优越的诊断性能。

总结

该研究纳入152例患者，58例(38.2%)在移植后4个月内通过ddPCR检测MRD阳性，中位变异等位基因频率为0.198%。allo-HSCT后检测到DTA突变(DNMT3A、TET2和ASXL1突变)与复发风险增加无关。排除DTA突变后，ddPCR-MRD阳性患者的累积复发率(38.7% vs. 9.7%， P<0.001)显著较高，无复发生存率(55.5% vs. 83.7%，P<0.001)和总生存率(60.5% vs. 90.5%，P<0.001)显著较低。在多因素分析中，非DTA基因患者的ddPCR-MRD阳性是累积复发率 (HR=4.02，P<0.001)、无复发生存期(HR=2.92，P=0.002)和总生存期(HR=3.12，P=0.007) 的独立不良预测因素。此外，ddPCR与多参数流式细胞术结合可以进一步准确识别高复发危患者(F+/M+，HR=22.44，P<0.001；F+/M-，HR=12.46，P<0.001；F-/M+，HR=4.51，P=0.003)。

该研究是移植后MRD监测领域的先驱，首次共同探索ddPCR联合MFC应用于预后预测，为大多数异基因造血干细胞移植后AML/MDS患者的MRD监测提供了一个可行选择；ddPCR-MRD是预测非DTA基因AML/MDS患者异基因造血干细胞移植后复发的可行方法，与MFC联合使用更准确。

参考文献

Chen, W., Huang, J., Zhao, Y. et al. Measurable residual disease monitoring by ddPCR in the early posttransplant period complements the traditional MFC method to predict relapse after HSCT in AML/MDS: a multicenter retrospective study. J Transl Med 22, 410 (2024). https://doi.org/10.1186/s12967-024-05114-w