读书报告 | 阻断基因组不稳定性预防黑色素瘤对MAPK抑制剂获得性耐药

导读

阻断癌症基因组不稳定性可能会阻止肿瘤多样化和治疗耐药。本文发现，在患者和患者来源的异种移植物模型（PDXs）中使用MAPK抑制剂（MAPKi）治疗后，转移性皮肤黑色素瘤的获得性耐药基因组通过复杂基因组重排（CGRs）和染色体外DNA（ecDNAs）特异性扩增耐药驱动基因、非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复(HRR)基因。几乎所有敏感和获得耐药基因组都有普遍存在的泛发性嗜色区（pervasive chromothriptic regions），具有不成比例的高突变负荷，并且与ecDNA和CGR跨度有显著重叠。ecDNA和CGR扩增子内的体细胞突变经常富集HRR标签，特别是在获得性耐药肿瘤内。无论敏感还是耐药，断裂点序列分析均表明，NHEJ对于CGR和ecDNA形成的双链DNA断裂修复至关重要。在人类黑色素瘤细胞系和PDXs中DNA-PKCS抑制剂靶向NHEJ可减少ecDNAs和CGRs和预防/延迟获得性MAPKi耐药。因此，本文提供给我们一个关键的治疗思路，即靶向基因组不稳定性的起因能够预防获得性耐药（Cancer Discov. 2023 Apr 3;13(4):880-909. doi: 10.1158/ 2159-8290.CD-22-0787）。

Introduction

逆转耐药进化的科学努力主要集中在靶向获得性弱点。相比之下，在接受靶向治疗的患者中，导致癌症快速发生耐药的机制（例如基因组不稳定通路）仍知之甚少。

患者对BRAFi + MEKi治疗的获得性耐药是通过高频基因扩增发生的，单独或联合基因扩增可重新激活MAPK通路。

皮肤黑色素瘤是一种在预先未接受过靶向治疗的情况下，染色体碎裂负担本底很高的癌症，而染色体碎裂似乎是癌症快速产生和积累高度动态结构变异体（SVs）的关键进化机制。与SV相关的扩增子可以被识别为染色体内复杂基因组重排（CGRs）和染色体外DNA（ecDNAs，又名double minutes），它们可能是时间相关的结构，赋予一系列基因组信号可塑性。ecDNAs的非孟德尔遗传、其可及的染色质，以及ecDNAs劫持增强子和转录枢纽聚集，都是促进快速适应极端应激(如癌基因靶向治疗）的机制。

晚期皮肤黑色素瘤队列和全基因组测序数据特征

第一个队列包括患者匹配的正常组织以及MAPKi治疗前的BRAF^V600MUT黑色素瘤，以及初始缓解后的疾病进展时的组织（n=10个正常组织；n=10个治疗前肿瘤；n=17例获得性耐药肿瘤；N=10位病人）。第二组由快速尸检的黑色素瘤组织构成（n=3个正常组织；1例为BRAF^V600MUT敏感肿瘤；获得性耐药肿瘤12例；n=3例死亡受试者，均接受MAPKi治疗；n=6个转移器官部位）。第三个队列由BRAF^V600MUT或NRAS^MUT PDX肿瘤组成。本研究对PDXs（N=6；在NOD-scid IL2R gamma null（NSG）小鼠中，1个BRAF^V600MUT模型和5个NRAS^MUT 模型）的MAPKi治疗的剂量足以引起肿瘤消退，然后产生获得性MAPKi耐药肿瘤（n=6个对照治疗的肿瘤；获得性耐药肿瘤12例；N=6例正常组织）

获得性耐药 vs. MAPKi-Naïve的黑色素瘤中ecDNA和CGRs的复发、数量、染色体起源和复合体

共58例BRAF^V600MUT和NRAS^MUT的MAPKi敏感/naïve和获得性耐药肿瘤（n=17例敏感肿瘤；N = 41例获得性耐药肿瘤；n=19例病人）

将所有三个队列合并后，我们观察到，与敏感相比，获得性耐药的基因组中的ecDNA和CGRs数量较多（获得性耐药：总N =941，每个肿瘤n=31；敏感：总N=241，平均每个肿瘤16个；配对t-test，P=0.09）

CGR-和ecDNA-扩增子驱动MAPKi耐药

A~D：染色体内CGRs和ecDNA导致的扩增子分析发现获得性耐药肿瘤和携带真正MAPKi耐药驱动基因的CGRs/ ecDNA之间有显著的相关性（P=0.0002）。已知BRAF、NRAS、HRAS、MYC和EGFR，在扩增时，可驱动获得性MAPKi耐药和MAPK通路的再激活

A：使用被称为CRISPR-CATCH的新方法，通过直接分离和高深度测序（NRAS扩增）对复发ecDNA进行验证。这一替代技术证实了这一获得性耐药临床肿瘤样本中890kb驱动ecDNA的环状连接

E：使用DNA-FISH交叉验证耐药特异性存在和BRAF/NRAS扩增子的CNs

DSBs的NHEJ和HRR被认为是染色体畸变后CGR和ecDNA产生的关键

F：XRCC2（RAD51-like; CN, 49）、一个关键的HRR基因；XRCC6（KU70; CN, 14-15）、一个关键的NHEJ基因；在获得性MAPKi耐药黑色素瘤中特异性扩增为ecDNA

G/H：在ecDNA或CGR扩增子中鉴定出的与敏感、耐药或敏感加耐药特异性相关的耐药特异性基因及其CNs。重要的是，ecDNA和CGRs的基因扩增在MAPKi治疗中促进疾病进展

I：通路富集分析

黑色素瘤的普遍嗜色性基因组跨越与ecDNA和CGRs的基因组坐标重叠

如果染色体碎裂是黑色素瘤疾病进展期间产生ecDNA和CGR的前体步骤，我们预计受累基因组跨度会出现非随机重叠

A：在MAPKi敏感/naïve基因组中约29%（5/17）和获得性MAPKi耐药基因组中约~54%（22/41），观察到ecDNAs和CGRs的基因组跨度与显色区显著或非随机重叠

A：在ecDNA+ CGR和染色质区之间有重叠的每个肿瘤基因组中，我们观察到显著的非随机收敛（P<0.00001），提示染色体畸变是ecDNA和CGRs的起源

Chromothripsis标签、ecDNAs和CGRs的肿瘤突变负荷（TMBs）和单碱基置换（SBS）

我们已经报道了临床黑色素瘤的MAPKi选择改变了突变谱

为确定MAPKi相关的突变体表型如何影响MAPKi选择的染色体稀少基因组，我们剔除了MAPKi敏感/naïve（平均，64 SNVs/Mb）vs. 耐药基因组（平均，58 SNVs/Mb）特有的染色体稀少体细胞突变，并分析了SBSs标签

获得性MAPKi耐药的独特和反复发生的是检测到DNA错配修复缺陷（MMR）的突变标签（SBS6, SBS20, SBS26, SBS44；31例耐药肿瘤中14例；16例患者中，10例为基底切除修复（BER）缺损（SBS18、SBS30、SBS36）

在获得性耐药（平均130 SNVs/Mb）肿瘤中，CGR+ ecDNA相关的TMB有高于MAPKi敏感/naïve肿瘤（平均80 SNVs/Mb）的趋势

与患者匹配的敏感肿瘤（1/12）相比，SBS3的富集(缺陷的HRR)在耐药肿瘤的ecDNA/CGRs中更频繁（11/28）

25%（7/28）的获得性耐药肿瘤在ecDNA和CGRs的缺陷HRR标签（SBS3）中显示阳性富集评分，而在敏感肿瘤中仅8%（1/12）

简言之，无论是在MAPKi敏感/naïve还是获得性耐药肿瘤中，ecDNA和CGR扩增子都具有提示HRR特异性缺陷或缺陷的SBS模式

NHEJ是EcDNAs和CGRs形成的基础

D：分析CGRs和ecDNAs的断点连接序列以推断耐药相关扩增子的DSB修复过程。对所有耐药和敏感性相关CGRs和ecDNA的断裂连接序列分析表明，NHEJ是双链DNA片段连接或重排的主要机制。更少的断裂点序列显示短的和长的同源序列以及插入（>10 bp），分别提示通过NHEJ和HRR修复DSB

E：对含有MAPK再激活或MAPKi抗性驱动基因的特异性ecDNAs和CGRs的断点连接序列的分析也揭示了类似的模式，NHEJ在DSBs修复机制中占主导地位

DNA-PKi和/或PARPi预防黑色素瘤细胞系获得性MAPKi耐药

DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKCS）和PARP1/2参与多种DSB修复通路，尤其是NHEJ（DNA-PKCS）、HRR（DNA-PKCS, PARP1/2）和MMEJ（PARP1/2）

检测了特异性DNA-PKi NU7026和PARP1/2抑制剂ABT888（维利帕利）单独和联合的活性，以阻止人BRAFV600MUT和NRASQ61MUT黑色素瘤细胞株分别用BRAFi+MEKi或MEKi处理中DTPPs克隆的出现

本文进一步假设，一旦慢性MAPKi治疗完全建立，DNA-PKi可以更有效地预防而不是逆转耐药性

NU7026+MAPKi在所有亲本细胞系中具有协同作用和剂量依赖性，而ABT888在6个亲本细胞系中的3个中显示出活性（A/D/J）

A/D/J：在ABT888单独抑制DTPP形成的情况下，NU7026加ABT888对获得性MAPKi耐药的抑制作用甚至更强

在所有获得性MAPKi耐药的亚株中，与在等基因亲本株中观察到的活性相比，NU7026（或ABT888）在较低浓度范围内没有或降低了抗克隆活性

A~C：对中期细胞进行DNA-FISH，并对BRAF、RAF1和NRAS以及第7、3和1号染色体的着丝粒进行探测。在获得性耐药中观察到BRAF以HSRs（M249 DDR4 and DDR5）或ecDNAs（M395 DDR）的形式扩增；RAF1作为HSRs和ecDNA（M245 C3)的混合物；NRAS作为HSRs（M245 C5）。预期，这些驱动ecDNAs和HSRs在等基因亲本细胞系中未检测到。

A~F：观察到从获得性耐药亚系中撤出MAPKi显著减少了具有驱动ecDNAs和HSRs的中期细胞，并显著增强了它们的MAPKi敏感性

DNA-PKi在体内阻止耐药性并减少ecDNA和CGR大小