外泌体实验如何开展？这篇11分文章教您深入浅出玩转外泌体！

2022-06-16 Eric MedSci原创

随着非编码RNA相关研究内容的井喷，高分杂志对非编码RNA研究的要求也水涨船高。今天就来向大解析外泌体介导的非编码RNA参与疾病进展的研究应该如何开展。

随着非编码RNA相关研究内容的井喷，高分杂志对非编码RNA研究的要求也水涨船高。今天就来向大解析外泌体介导的非编码RNA参与疾病进展的研究应该如何开展。

文章来自2022年3月份发表于Molecular Therapy杂志（11.454分）的“Exosome-derived circTRPS1 promotes malignant phenotype and CD8+ T cell exhaustion in bladder cancer microenvironments”,讲述了在膀胱癌中外泌体来源的circTRPS1促进细胞恶性表型及CD8阳性T细胞耗竭促进肿瘤进展的分子机制。

本文研究思路如下：

一、背景

膀胱癌 (BCa) 是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，但是其发生发展的分子机制仍不明确。外泌体在细胞间的通讯中发挥着重要的作用，可以包裹如circRNA, lncRNA, microRNA等多种遗传物质参与疾病进展。本研究就从膀胱癌细胞分泌的circRNA TRPS1入手，系统地展开了癌细胞外泌体通过传递circRNA作用于微环境中的其他癌细胞，影响肿瘤细胞的代谢重编程以及CD8阳性的T细胞耗竭，进而促进肿瘤进展。

二、研究思路解析

第一部分：确定主要研究的circRNA

一般情况下，筛选差异表达的主要研究分子可以采用公共数据库挖掘的方法，也可以使用自己收集的样本进行高通量的测序。在这篇文章中，作者选取4V4的膀胱癌病人样本，通过高通量测序筛选了差异表达的circRNA基因，确定了研究的主角circTRPS1。随后通过荧光原位杂交 (FISH) 在90对膀胱癌组织中验证了circTRPS1 在膀胱癌组织中表达上调。单纯的测序结果可能不一定准确，因此在此处需要追加相关的验证。

上述的生信分析和验证是确定了研究的主角分子。一般筛选做到上述内容已经比较完整，但是除此之外作者还发现circTRPS1 表达水平与膀胱癌患者总体存活率呈负相关。检测了尿源性外泌体中不同膀胱癌临床阶段的circTRPS1表达水平，发现circTRPS1可以作为诊断膀胱癌进展的临床标志物。这两个部分的内容为整体人体样本的内容增色不少。

第二部分：circRNA的功能验证

在明确主角分子后，作者在细胞水平开始了基因功能的研究。作者首先检测了人正常尿路上皮细胞系 SV-HUC-1 和膀胱癌细胞系RT4、UM-UC-3、T24、5637 和 J82 中 circTRPS1 的表达。发现在膀胱癌细胞中circTRPS1表达是明显升高的。这是与第一部分相对应，在细胞层面验证circTRPS1的表达在膀胱癌进展中表达是明显升高的。随后通过构建si-NC和si-circTRPS1的质粒，转染膀胱癌细胞，通过CCK8、EdU染色、流式检测分析circTRPS1对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响。

最后作者分离了正常尿路上皮细胞系SV-HUC-1 和膀胱癌细胞系RT4、UM-UC-3、T24、5637 和 J82的细胞培养基中的外泌体，同样发现circTRPS1在膀胱癌细胞来源外泌体中是表达升高的。用敲减circTRPS1的UM-UC-3、T24细胞外泌体重新孵育UM-UC-3、T24细胞，可以降低细胞的增殖和侵袭。用过表达circTRPS1的5637细胞来源的外泌体，可以促进细胞的增殖与侵袭。在本部分实验中使用预转染circRNA后分离的外泌体可以起到与单纯转染circRNA同样的效果，这证明正是外泌体中包含的circRNA影响了相应的细胞功能。（这一项对照实验在外泌体相关的研究中非常重要）。

第三部分：circTRPS1下游的机制研究（经典的海绵吸附机制，寻找下游microRNA）

在此部分中，作者探究了circRNA的作用机制。首先作者通过生物信息学的方法筛选出了circTRPS1下游可能吸附的microRNA(包括miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-125a-5p 和miR-125b-5p)，随后通过RIP实验发现miR-141-3p和miR-200a-3p与circTRPS1的作用最为紧密。通过RNA pull-down实验发现 circTRPS1 与 miR-141-3p 的相互作用多于 miR-200a-3p。最后通过荧光素酶报告实验确定miR-141-3p为最合适的靶基因。

第四部分：circ TRPS1-miR-141-3p轴靶基因的确认

在此部分中作者进一步探究了circTRPS1-miR-141-3p轴下游起到关键作用的靶基因。作者对肿瘤发生过程中的代谢重编程非常感兴趣，所以使用了代谢组学来探究肿瘤的代谢变化，发现敲减circTRPS1 后膀胱癌细胞中的谷氨酰胺代谢、糖异生、谷氨酸代谢和脂肪酸氧化是主要的富集代谢途径。随后作者又进行了RNA测序，发现GLS1基因在敲减circTRPS1后出现了显著下降，且荧光素酶报告实验验证了其与miR-141-3p的结合。GLS1是细胞谷氨酰胺代谢中的关键基因，因此被确定为靶基因。

第五部分：靶基因GLS1的特色功能实验

确定了膀胱癌进程中的circTRPS1-miR-141-3p -GLS1轴后，作者根据靶基因GLS1的独特功能，进行了靶基因的特色功能实验，如细胞增殖、凋亡、细胞代谢等（主要见于附件图）。此外作者还发现circTRPS1表达与CD8阳性的T细胞的数量有一定的相关性，因此在人体标本中进行了一些验证。

第六部分：动物模型验证circTRPS1的功能

在这部分中作者首先将转染sh-NC和sh-circTRPS1 的T24细胞皮下注射到裸鼠体内，观察到T24-sh-circTRPS1的异种移植物肿瘤生长显着降低，这表明 circTRPS1 促进了体内肿瘤的生长。随后作者分离了sh-NC和sh-circTRPS1转染细胞后分离的外泌体，与此同时加用BPTES（靶基因GLS1的抑制剂）注射小鼠，他们发现使用靶基因GLS1的抑制剂后，肿瘤大小较单纯使用sh-circTRPS1外泌体注射的缩小显著，这再次在体内实验中验证了circTRPS1-miR-141-3p -GLS1轴参与膀胱癌的进展。

三、总结

这篇文章的套路并不是十分新颖，且工作量较一般的circRNA文章相对少一些，但是有很多的亮点值得我们学习和借鉴，尤其值得小白上手。外泌体是主要的亮点之一，做外泌体相关研究首先就是确定载体细胞和受体细胞是什么？本文中载体细胞和受体细胞都是膀胱癌细胞。但是在其他课题中可能就是实质细胞与间质细胞了，这一点首先一定要明确。随后要明确外泌体传递的是什么，可能是非编码RNA（较多）也可能是蛋白质，这一点也是要明确的。一般我们实际工作中都是采用测序来进行筛选。明确了以上两点之后，一个外泌体课题就可以转化为一个普通的非编码RNA课题了,套路也比较容易模仿了。此外一些技术性的问题，如电镜检测、外泌体分离、外泌体示踪这些实验都有比较成熟的检测机构或商业试剂盒。

最后本文除了外泌体之外也有很多亮点。比如本文工作非常工整，细胞、动物、人体三个维度均有涉及。尤其是在人体部分使用了大量的样本，这是一般课题可能较难达到的。其次就是本文的靶基因做的是能量代谢方面，是一个较为新颖的切入点，也为本文增色不少。T细胞的耗竭也是一个不错的方向，本文在这方面也取得了一定的结果。

来源：https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(22)00022-3?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1525001622000223%3Fshowall%3Dtrue

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