四川大学徐建国/李乙文《AFM》: 原花青素能增强米诺环素对脑出血的神经保护作用！

当脑出血(ICH)治疗缺乏有效的神经保护干预措施时，通常预计预后不良。米诺环素(Mino)是一种有前途的临床神经保护候选药物，用于急性脑出血治疗，主要抑制小胶质细胞/巨噬细胞的激活。然而，为了解决铁的神经毒性、铁死亡和氧化应激引起的多种神经损伤机制，米诺环素的神经保护作用仍亟待增强。为了解决这个问题，四川大学徐建国&李乙文利用典型的天然多酚原花青素(PACs)，以3-氨基苯硼酸为交联剂构建PACs-Mino纳米颗粒(NPs)，以提高Mino的神经保护作用。所产生的纳米粒子在体外具有改善的抗氧化和除铁能力。更重要的是，PACs-Mino NPs 对 ICH 具有优异的治疗效果，在体外细胞模型和体内 ICH 大鼠模型中显示出改善的神经保护活性并导致神经行为恢复。这项研究可以提供一种利用天然多酚来提高脑出血治疗药物性能的通用策略，并且该结果可能进一步扩展到中枢神经系统的其他损伤，例如脑损伤和脊髓损伤。该研究以题为“Procyanidins Boost the Neuroprotective Effect of Minocycline for Intracerebral Haemorrhage”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

【制造和表征】

该研究以3-氨基苯硼酸为交联分子，通过动态硼酸盐-儿茶酚键和席夫碱键整合PACs和Mino的单锅反应制备了PACs-Mino NPs。该NPs在不同介质中具有长期稳定性，不会迅速塌陷或膨胀。NPs内存在许多席夫碱和硼酯键，这导致了潜在的酸响应性。因此，推测NPs应该具有释放米诺环素以响应酸的能力。结果表明，释放的Mino量随着pH值的降低而增加。然后，进一步研究了NPs的抗氧化、自由基清除和亚铁离子螯合能力等几种典型性质。发现NPs可以显著增强Mino的自由基清除和亚铁离子螯合能力，这可能是由于具有丰富的儿茶酚和没食子酸结构的PAC参与。这些特性的改善可以帮助有效地阻断导致ICH后细胞凋亡的损伤途径，并促进在减少脑损伤和改善神经功能方面取得更大的成果。

图1.NPs的制造和表征

【NPs的细胞内保护能力】

为了更真实地模拟NPs对CNS的保护作用，选择小鼠海马神经元细胞系(HT-22细胞)来评估NPs在H₂O₂、谷氨酸和FAC。HT-22细胞与NPs孵育24小时和48小时后，NPs在浓度低于300 μg mL⁻¹时表现出良好的细胞相容性。NPs对浓度低于22 μg mL⁻¹的HT-200细胞具有明显的保护作用。此外，与相同浓度的PACs和Mino单体处理相比，NPs处理后的Fe阳性细胞更少，这表明NPs可以有效增加细胞中铁离子的去除，降低铁过载的毒性。

ROS是ICH期间导致脑损伤的最重要的自由基。PACs被证明对广谱自由基具有出色的清除效果。事实上，NPs相对于Mino具有优异的ROS清除和铁螯合能力，以及其在体内ICH动物模型中的巨大应用潜力。

图2. NPs的细胞内保护能力

【NPs对脑出血大鼠的神经保护作用】

在本研究中，采用胶原酶诱导的大鼠脑出血模型(右侧纹状体)，研究了NPs的体内神经保护活性。考虑到在脑出血早期应用Mino并维持其剂量可产生更有效的神经保护作用，本研究在脑出血诱导后2 h经尾静脉注射NPs(NPs组)、PACs(PACs组)、Mino(Mino组)和PBS溶液(ICH组)，并在24 h和48 h再次注射这些药物。结果表明，NPs比Mino具有更强的促进M1小胶质细胞/巨噬细胞向M2小胶质细胞/巨噬细胞转化的能力，从而达到有效的抗炎作用。与其他三组相比，纳米粒可以通过阻断脂质过氧化链式反应和提高抗氧化酶活性而显著减轻脑出血模型大鼠的氧化应激。这些结果与上述体外结果和细胞内ROS水平相一致。

图3. NPs对ICH大鼠的体内抗氧化和抗炎特性

铁含量可参与ICH后的多种不良反应，如自由基产生、线粒体损伤和巨噬细胞/小胶质细胞活化等。因此，利用Perl的普鲁士蓝染色进一步研究了ICH大鼠模型中NPs的亚铁离子螯合活性;研究发现，与其他三组相比，NPs处理在ICH诱导后7天显着减少了血细胞周围铁蛋白阳性细胞的数量。总之，NPs治疗可以有效降低氧化应激，抑制炎症和去除铁离子，从而激发优异的神经保护活性。 

图4. NPs对ICH大鼠的体内铁螯合和抗凋亡能力

【神经解剖结构和功能恢复】

与Mino和PACs相比，NPs治疗ICH模型大鼠可以更有效地减少急性期的继发性脑损伤。因此，进一步探讨了ICH模型大鼠早期NPs治疗后长期随访期间血肿神经解剖结构和神经行为功能的变化，并加入假手术组作为正常标准的参考。胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是一种星形胶质细胞特异性蛋白，通常在星形胶质细胞增多期间增加，并在CNS损伤后保持升高，代表长期结构改变(胶质瘢痕)。采用免疫荧光染色和定量分析方法检测GFAP和NeuN的表达，以评估脑出血诱导28天后脑出血区神经元和胶质瘢痕的分布。与其他三组相比，NPs组Neun阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞的分布与假手术组最为相似，统计分析进一步证实了这一结果。

图5.ICH区神经元分布及神经胶质瘢痕研究

众所周知，纹状体周围环绕着大量的上下游纤维束，控制着身体的神经生物学行为。有髓神经纤维由中枢纤维和周围髓鞘组成，两者结构的完整性维持其功能。本研究采用免疫荧光染色方法，观察脑出血区髓鞘和神经纤维的分布。NPs组脑出血区神经纤维和髓鞘分布明显增多。脑出血模型大鼠急性期给予NPs后，血肿区的神经解剖结构较接近正常(假手术组)，结果表明，与Mino和PAC相比，脑出血诱导后早期应用NPs能更有效地保护和维护血肿内神经解剖结构的完整性，从而获得更好的神经功能恢复。

图6.髓鞘和神经纤维在ICH区域的分布和神经行为评估

【小结】

该研究开发了PAC-Mino NPs，通过将其与PACs整合来提高Mino的ROS清除，抗炎和铁螯合性能。所得NPs在大鼠ICH急性期确实表现出增强的神经保护活性，长期观察表明NPs可以更好地保持神经解剖结构的完整性，促进神经功能的恢复。本研究可以刺激其他种类的纳米药物的开发和临床应用，这些纳米药物以天然多酚为平台，以增强ICH治疗药物的性质，这些发现可以进一步扩展到CNS的其他损伤，如脑损伤和脊髓损伤。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202303379