Neuron：何志刚院士合作报道促进轴突再生和神经元存活的新机制
2022-08-02 brainnew神内神外 网络
通过scRNA-seq分析表明，这些干预措施下调了与细胞死亡相关的基因表达程序，并上调了与生存和再生相关的程序。
成年动物中枢神经系统（CNS）神经元再生轴突和形成新突触的能力有限，CNS神经元轴突的损伤通常会导致永久性功能缺陷。为了应对这一挑战，许多研究小组使用轴突损伤模型来寻找改善轴突再生和神经元存活的分子。
一种常用的模型是视神经挤压（ONC），它通过切断视网膜神经节细胞（RGC）的轴突，将视觉信息从视网膜传输到大脑其他部分的投射神经元。在小鼠中，90%的RGC在ONC后的一个月内死亡，并且很少有幸存者将新的轴突延伸到损伤部位超过几百微米。
通过该模型，已经发现了几种改善生存和/或轴突再生的干预措施，但迄今为止，仍没有一种干预措施足以恢复正常的视力。
为了阐明促进或限制神经元存活和轴突再生的途径及分子效应，哈佛大学何志刚院士和Joshua R. Sanes教授等人专注于三种干预措施，分别为细胞质磷酸酶（Pten）的条件缺失，阴性调节因子信号传导（Socs3）的条件缺失以及细胞因子和神经营养因子（CNTF）的OE。文章发表在最新的Neuron杂志上。
所有干预措施均使用玻璃体内注射的AAV2载体，以相对RGC选择性的方式操纵靶基因表达。结果发现三者中的每一个单独或组合，都已被证明可以增强RGC存活和轴突再生。同时，这三者的组合比任何一个单独的组合都更有效，尽管在这种情况下，也很少有轴突再生到它们的目标。
图1 将AAV2-Cre注射到PTENf/f（PCKO）或Ptenf/fSocs3f/f（PSCKO）小鼠的玻璃体中，以在ONC前2周制备无基因的组织。按照指示（C/PCKO 或 C/PSCKO）共同注射编码睫状神经营养因子（CNTF）的AAV2。此后在指定时间收集RGCs作为scRNA-seq。
RGC类型在适应力方面差异很大，适应力最强和最弱的类型在14天时分别显示出99%和1%的存活率[1,2]。这些分子差异能够帮助确定神经保护的靶标。Anne Jacobi等人的通过高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了未受伤，受伤和治疗后的RGC，并使用最新的标准将其分为46种不同的类型。
Anne Jacobi等人想探究提高生存率的干预措施是否选择性地作用于不同类型。然而，Anne Jacobi等人发现这些干预措施几乎没有选择性；因此，这些结果表明，中枢神经系统神经元的广泛和延长的长距离再生可能只有在同时操纵多个基因/因子时才有可能实现。
之后，Anne Jacobi等人收集了再生轴突的RGC，并将其与存活但未再生的RGC进行比较，观察干预措施是否促进特定类型的再生。接下来，Anne Jacobi等人使用五种独立的计算方法，按RGC类型，状态，损伤后时间和干预措施来分析基因表达，寻找与这些变量相关的表达模式。
这些方法富集到三组基因：一个由退化或易受攻击的RGC选择性表达，第二个由存活但未能将轴突延伸1mm的RGC选择性表达，第三个由不仅存活但还存活的RGC还将轴突延伸到挤压部位至少1毫米处的RGC选择性表达。
图2可看到这些程序随时间的变化，在WT小鼠中，所有三个模式中的基因在ONC后均上调，随后死亡模块继续增加，但存活和再生模块的并未保持增加而是恢复到初始状态（左图）。形成鲜明对比的是，C/PSCKO小鼠的视网膜中死亡模块的增加是短暂的，但存活和再生模块的增加是显着和持续的（右图）。PCKO小鼠（中图）是一个居于中间的模式。
总之，这些模式给出了干预如何促进神经元存活和轴突再生的意义。在绘制了这些模块之后，Anne Jacobi等人确定了与每个组相关的基因表达模式。
图2 野生型小鼠和干预后小鼠在ONC后的死亡，存活和再生模块基因的表达
之后Anne Jacobi等人通过在几个时间点收集和分析细胞，跟踪了由Pten、Socs3和CNTF调节的基因表达模式。结果发现了干预效果的多个时间阶段。
首先，在损伤之前和独立于损伤的情况下，基因表达有适度的上调。其次，在ONC之后的前两天内几乎没有变化。第三，防止进一步的退行性变化，并在2至7天之间激活生存和再生的基因表达。最后，基因表达变化在7到21天之间是稳定的。
后面为了检测与再生相关的基因是否参与到这一过程，我们使用了功能增益实验，其中我们过度表达存在于再生模块中的基因。结果发现Crh，Gal和Wt1能导致显着的轴突再生，支持该策略可以作为一类新型治疗靶点。
综上所述，该研究主要探究了促进损伤后视网膜神经节细胞的存活和再生的干预措施。通过scRNA-seq分析表明，这些干预措施下调了与细胞死亡相关的基因表达程序，并上调了与生存和再生相关的程序。过表达一些再生模块基因可增强体内RGC存活和轴突再生，为临床提供了新的治疗策略。
[1] Tran NM et al., Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes, Neuron (2019), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.11.006
[2] Duan X et al., Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling, Neuron (2015), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2015.02.017
[3] Jacobi et al., Overlapping transcriptional programs promote survival and axonal regeneration of injured retinal ganglion cells, Neuron (2022), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.06.002
编译作者：Amy Yao（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
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