IVD新技术丨诊断慢性炎症的新型标志物

炎症是宿主通过招募免疫细胞和非免疫细胞来保护自己免受毒素、细菌、病毒、组织损伤和代谢应激的过程。在生理背景下，炎症是保护性的，一旦损伤被消除，但当炎症无法消退时，长期的炎症状态可能变成慢性和病理性的。大多数慢性病的发病前都有慢性低度炎症。在最常见的慢性疾病中，心脏病、癌症、肥胖和2型糖尿病(T2D)是美国致残和死亡的主要原因。鉴于其广泛的表现、住院人数和死亡率，这些疾病构成了巨大的社会经济负担。事实上，受影响的受试者需要持续的医疗关注，从最初的症状到治疗方案的管理。

因此，确定前沿诊断工具对于建立预防方法和有针对性的药理学干预至关重要，目的是尽量减少慢性病的风险、痛苦和最终成本。最近的研究报道了唾液在检测心血管疾病(CVD)、全身和局部炎症、内分泌和代谢紊乱方面的诊断效用。唾液脂质主要由大唾液腺分泌，但一些脂质如胆固醇和脂肪酸(FAs)直接从血清扩散到唾液中，因此，使用唾液作为另一种诊断工具是可取的。此外，大量唾液可以很容易地收集和储存，具有非侵入性和节省成本的程序。因此，在唾液样本中检测和量化生物标志物的机会对于研究、临床和主动医疗保健应用变得非常有吸引力，目的是早期诊断慢性疾病并允许持续的疾病监测。

近日一组来自意大利的研究团队在杂志International Journal of Oral Science上发表了一篇题为“Salivary biomarkers: novel noninvasive tools to diagnose chronic inflammation”的综述文章。

本综述旨在讨论使用尖端技术发现唾液生物标志物的优势和挑战，这些生物标志物可能用于诊断/治疗几种具有炎症后果的慢性疾病，并寻求可能用唾液中可检测的可溶性介质取代传统途径。

图片来源：International Journal of Oral Science

一、炎症状态的调节剂

炎症环境首先受到触发事件的影响，从而决定不同数量和类型的免疫细胞的募集，并相应地决定促炎介质的多样化释放。然而，有几个因素可以导致炎症的血清生物标志物的动态变化，包括年龄、肥胖、性别、饮食、吸烟、遗传、药物消耗和肠道微生物群。

年龄：衰老的特点是血清细胞因子和急性期蛋白(APPs)水平的增加，表现出低级别炎症状态。白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNFα)、IL-1以及c反应蛋白(CRP)、α1-酸性糖蛋白和纤维蛋白原随着年龄的增长而增加在健康的老年人群中。这些细胞因子可能是动脉粥样硬化、T2D、AD、血栓栓塞并发症的危险因素，并与肌肉减少症和肌肉损失相关。其他一些细胞因子，比如IL-18、IL-2、IL-17和IL-12水平较高，与老年人心血管疾病、中风、1型糖尿病、AD和骨关节炎有关。

肥胖：肥胖与低度慢性炎症有关。内脏脂肪产生几种促炎细胞因子(TNFα， IL-1, IL-6)和趋化因子(MCP-1)。有研究表明，TNFα途径可能参与了循环瘦素的调节，而肥胖受试者的循环瘦素水平升高。肥胖的状态还与缺乏运动密切相关，有氧运动可以减少循环中的IL-6和CRP。在一项大型干预研究中，与不运动的受试者相比，进行体育锻炼的受试者CRP浓度降低了41%。

性别：临床研究结果表明，炎症反应在性别上是不同的。有一项研究评估了高加索人群中2884名男性和3201名女性的细胞因子和APPs水平的决定因素，男性性别与IL-6和TNF-α水平呈正相关，而与IL-1和CRP水平无关联。在多种疾病中，已观察到男性和女性之间的脂质介质水平存在差异，如II型糖尿病中的前列腺素(PG)、慢性阻塞性肺疾病中亚油酸衍生的脂质介质、AD中的DHA、代谢综合征中的脂氧素A4 (LXA4)。

吸烟：吸烟和慢性炎症存在密切关系。香烟会引起氧化应激从而导致炎症反应，还含有几种具有免疫调节作用的毒素。IL-1β、IL-6、CRP和纤维蛋白原是香烟引起炎症的敏感生物标志物。与吸烟状态相关的脂质生物标志物，花生四烯酸(AA)衍生的脂氧合酶(LOX)代谢物，在吸烟者中比不吸烟者显著增加。此外，8-iso-PGF2α的排泄在吸烟或饮酒的个体中呈剂量依赖性增加。相比之下，PGF1a、PGI2和前列PGF2a在吸烟者中明显低于非吸烟者。

表观遗传学和遗传学：表观基因组关联研究(EWAS)表明炎症期间基因组的整体低甲基化。事实上，miR-126、miR-132、miR-146、miR-155和miR-221最近被发现是TNFα、IL-8、MCP-1、IL-6和粘附分子的重要转录调节因子。表观遗传改变也可能影响慢性炎症性疾病的风险，15种特异性循环miRNA在青春期前肥胖中显著失调，包括血浆中miR-221和miR-28-3p的下调以及miR-486、miR-142-3p、miR-130b和miR-423-5p的上调。遗传多态性，特别是编码宿主防御系统分子的基因，如细胞因子，影响对慢性炎症的易感性。IL-6、TNFα启动子区域的突变直接影响细胞因子的表达，并与多种炎症相关。

慢性炎症可能的调节剂和可分析物示意图。

图片来源：International Journal of Oral Science

二、唾液生物标志物检测的方法

唾液取样和采集方法

就像葡萄糖和皮质醇的情况一样，炎症标志物IL-6在血液和唾液之间也显示出显著的相关性。唾液收集的黄金标准方法是“被动流涎”，可以很容易地取样唾液。此外，有许多标准化的口腔采样方案，唾液收集可以通过可穿戴模块轻松实现自动化。然而，唾液是一种复杂的液体混合物，来自不同的微环境如牙龈缝隙，其中可能存在一种特殊的微生物种群，往往不同于其他口咽区域。

其他收集方法包括吐痰、咀嚼和拭子法。吐痰收集唾液只涉及特定的唾液腺，如下颌下和小唾液腺；而咀嚼，通常通过使用蜡，允许收集主要来自腮腺的刺激唾液，是目前被推荐用于测量唾液中CRP浓度的介质。而对于其他炎症标志物，未受刺激的唾液仍然是最优选的液体。最后，基于拭子的方法已被广泛用于SARS COVID-19测试，但有证据表明，免疫分析测试显示，由于使用棉签，唾液标记物的浓度存在很大偏差。

使用唾液或血液检测临床相关分析物的利弊。

图片来源：International Journal of Oral Science

唾液生物标志物检测的标准方法

目前用于即时唾液诊断的商业产品的例子很少。成本和反应时间是评估这些程序时主要考虑的两个参数。最广泛的免疫测定法，金标准酶联免疫吸附测定法(ELISA)，它允许通过使用抗体功能化的板来检测目标抗原。一组生物标志物可以通过使用多路复用技术进行筛选，同时评估其浓度，提供更全面的结果和更快的交货时间。新工具的检测结果与ELISA进行比较是至关重要的。使用创新设备进行唾液筛查的研究并不总是提供比对金标准的验证结果，从而限制了所获得结果对临床试验的适用性。

分析唾液生物标志物的生物传感平台

虽然从原始唾液中分离出不需要的组分（比如非生物标志物蛋白质和碳水化合物）的方案可以最大限度地减少潜在干扰的影响，但是也可能损害目标生物标志物的浓度，如粘蛋白(一种牙周炎的炎症生物标志物)和基质金属蛋白酶，它们可以在膜过滤过程中从样品中丢失。因此现在全世界科学家正高度关注高选择性和敏感的生物传感平台的发展。

研究人员已经研究了几种材料(碳基或金基材料)作为生物传感器发展的有希望的替代品。石墨烯等先进的碳材料虽然价格昂贵，但其生产方法正在不断发展，而且资源丰富。金基材料结构简单，功能方便。电化学、光学和声学转导广泛用于开发检测唾液炎症生物标志物的生物传感器。电化学技术具有通用性、低成本和高便携性；光信号转导具有高灵敏度和选择性。声信号转导，可以改进信号采集达到非常低的检测限，但由于对高频率的依赖，在护理点的应用仍然存在局限性。

生物传感平台新视角

为了提高生物传感器的特异性和灵敏度，将分子印迹聚合物(MIP)技术应用于生物材料表面。在MIP中，特定的功能单体在目标分子(例如生物标志物)存在的情况下聚合，形成大小、形状和功能与目标分子互补的空腔，从而可以特异性地重新结合目标分子。MIPs不仅成功地应用于小分子识别，而且还成功地应用于生物大分子，如蛋白质。然而，基于MIP的生物传感器的工业应用受到限制，因为缺乏可重复制备和稳定性，以及分析物向腔和结合位点的缓慢扩散有限。

可穿戴生物传感器可以放置在口腔中，用于检测唾液生物标志物，并与计算机/智能手机进行无线通信，并实现在线数据分析。数据传输是通过WiFi和蓝牙低功耗产生的（如下图）。机器学习模型可用来识别特定疾病的多种循环生物标志物中的特征。机器学习算法可以实现完全自动化，并通过减少导致错误诊断的假阳性，在短时间内分析大型数据集，从而节省临床医生进行数据分析的时间。

尽管科学技术进步，但目前的生物传感器仍然限制了早期非侵入性的生物标志物检测。单一生物传感器检测多种生物标志物的技术仍然不成熟。因此，需要先进的生物传感器制造和生物标志物检测的多种技术来提高患者护理质量，并通过早期评估和诊断慢性病来降低成本。

用于非侵入性唾液分析的可穿戴口腔内生物传感平台综述。

图片来源：International Journal of Oral Science

三、唾液生物标志物:一种有吸引力的筛选和监测方法

急性期蛋白作为唾液生物标志物

慢性亚临床炎症和组织损伤与急性期蛋白的分泌有关，如触珠蛋白(Hp)、CRP、α 1-抗胰蛋白酶(A1AT)、纤维蛋白原和铁蛋白，分为正、负两种。

在正向调节的蛋白中，CRP已被认为是原发性和继发性心血管不良事件的预测因子，唾液中的CRP水平与血清样本中的CRP水平和全身性炎症中度相关。另一个被认为可能是亚临床炎症的唾液生物标志物的分子是Hp，它与皮质醇激素一起被研究。在LPS诱导的系统性炎症模型中，Hp和皮质醇均显著升高，且唾液和血液中的浓度密切相关。最后，唾液A1AT水平的评估可用于监测肿瘤干预的有效性。

唾液炎症的生物标志物

唾液测量经常显示不一致，主要是由于不同的方法应用，处理技术和收集时间。此外，每种唾液生物标志物的病理浓度范围仍有待确定。因此，为了将唾液作为一种可靠的诊断介质，建议采用标准的收集和保存程序。唾液和血清样本中可以量化多种白细胞介素(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等)、TNFα和促炎酶，如金属蛋白酶及其抑制剂。IL-1β、IL-6和TNFα的在血液和唾液水平之间的比较已被广泛探索，显示唾液的总体可靠性中等，一致性较低。

在唾液生物标志物中，miRNA在早期诊断和了解某些疾病的发病机制方面似乎非常有希望。在唾液中表达失调的miRNA包括克罗恩病中的miR-101和溃疡性结肠炎中的miR-21、miR-31、miR-142-3p/5p。有证据表明，唾液中的miR-940和miR-3679-5p是胰腺癌的可靠标记物，而miR140-5p和miR301a则是用于胃癌唾液诊断的有吸引力的分子。

唾液脂质介质水平也可用于诊断和预后目的。唾液白三烯B4 (LTB4)和PGE2升高与动脉硬化相关；哮喘患者唾液中的半胱氨酸白三烯（LTs）水平升高；唾液中PGE2水平升高与牙龈炎和牙周炎有关。Sjögren综合征(SS)患者唾液总脂计数普遍增加，PGE2和血栓素B2 (TXB2)升高。

氧化应激的唾液生物标志物

脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤产生的产物可以直接在唾液中进行评估，可能为诊断与氧化应激相关的全系统疾病铺平道路。大量研究表明，氧化/抗氧化介质的失衡可能在代谢综合征、T2D和CVD的发病和进展中发挥关键作用。胰岛素抵抗大鼠的血浆和唾液中均发现超氧化物歧化酶、抗坏血酸和谷胱甘肽（GSH）水平降低，证明了抗氧化屏障和ROS清除系统受损。唾液氧化还原生物标志物的评估似乎也适用于肥胖症、糖尿病、高血压疾病、慢性肾病、心力衰竭、神经退行性疾病和癌症的诊断和监测。例如，年轻肥胖受试者的唾液和血浆中总氧化状态增强，同时谷胱甘肽水平降低。

牙周炎患者和吸烟者的唾液中观察到更高水平的谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)和丙二醛(MDA)。唾液脂质异前列腺素(IPs)可以可靠地评估氧化应激的程度。同样，唾液中PGE2、PGF2α和前列腺素D2 (PGD2)的水平已被成功地用作慢性炎症过程的生物标志物，并用于评估吸烟和牙周炎引起的氧化应激程度。CAD患者唾液中8-OHdG、MDA和PC的含量显著高于健康个体，MDA水平与血清高敏CRP (hsCRP)和血浆纤维蛋白原相关，这是心血管事件的有力预测因子。

唾液和血液作为生物流体，利用生物传感器检测肽、DNA、RNA和蛋白质。图片来源：International Journal of Oral Science

四、结论

可溶性介质的测量概述了从诊断到治疗和随访的整个治疗路线。详细地说，一系列的急性期蛋白、细胞因子和趋化因子、脂质、促炎酶和氧化应激指标已被指出是生物体液中可靠的生物标志物。由于慢性疾病，其中包括心血管衰竭、肥胖、糖尿病和癌症，在上个世纪已经逐渐蔓延，迫切需要确定新的诊断策略来定制患者的管理和分期疾病。在这方面，越来越多的研究表明，唾液生物标志物调节将是慢性患者护理的一种创新和微创选择。因此，致力于特殊唾液分子的研究将为临床医生提供前所未有的机会。

此外，技术进步使可穿戴生物传感器在口腔内的实施能够自动检测和定量唾液中的生物标志物。这样就可以进行早期、非侵入性和不突发性的诊断，持续监测慢性疾病，并与医生进行早期和持续的沟通，从而提高患者护理质量，同时降低护理成本。

唾液测量经常显示不一致，主要是由于不同的方法应用，处理技术和收集时间。此外，每种唾液生物标志物的病理浓度范围仍有待确定。因此，为了将唾液作为一种可靠的诊断介质，建议采用标准的收集和保存程序。使用特定的一系列生物标志物和检测唾液技术来区分慢性疾病的每个阶段，以及制定唾液介质组作为合适的分子生物标志物，与患者的人口统计学，遗传学和人体测量学特征相结合的可能性，可能代表一种改进诊断和更准确评估预后的新工具。