反复种植失败患者微刺激方案IVF-ET助孕成功一例及文献复习

胚胎反复种植失败（repeated implantation failure，RIF）是体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕失败的主要原因之一。目前对于RIF的认识尚不足，其定义、诊断以及治疗均存在较大的争议。对于RIF患者应当进行较全面的检查与评估，尽可能找到原因并针对原因进行相应的处理。

2020年欧洲生殖与胚胎协会一项针对临床医生和胚胎学家对RIF认知的研究表明，大部分人认为RIF与夫妻双方的生活习惯有一定的关系，关于RIF治疗达成最高共识的是孕前治疗，包括控制体质量指数(BMI)、戒烟等生活方式调整，其次是IVF过程中的治疗。

RIF的影响因素可以概括为胚胎因素和母体因素两个方面，母体子宫内膜容受性异常及其他多重因素均可能造成RIF，此外还有部分RIF原因不明。本文结合一例不明原因RIF患者的助孕经过，从目前RIF的病因及临床治疗等方面进行整理和总结，探讨患者成功妊娠的可能原因，为RIF的诊疗提供新思路。

病例资料

患者周某某，32岁，G0P0，因“未避孕未孕4年”就诊。

患者夫妇结婚4年，性生活正常。月经周期规则，初潮13岁，7 d/23~26 d，量中等，轻度痛经，无性交痛。既往2014年“梅毒感染”正规治疗。

2018年7月因“原发不孕、双侧输卵管积水”在外院行第1周期IVF助孕。短效长方案，促性腺激素(Gn)总量为卵泡刺激素(FSH) 1 500 U、人绝经期促性腺激素(HMG) 525 U，共获卵14枚，正常受精9枚，形成8枚D3优质胚胎，鲜胚移植2枚未孕，冻存6枚。

2018年10月行宫腔镜下子宫内膜息肉摘除术，术后降调节+激素替代周期冻融胚胎移植(FET)2枚D3胚胎未孕。2018年12月行腹腔镜下盆腔粘连分离+双侧输卵管积水切除+宫腔镜检查术，术后再次行降调节+激素替代周期FET，移植2枚D3胚胎未孕。生殖免疫相关检查，提示α-胞衬蛋白阳性，予口服羟氯喹、阿司匹林、泼尼松、二甲双胍治疗；2019年6月激素替代周期FET，移植2枚冻融D3胚胎妊娠，移植后予低分子肝素、重组人粒细胞刺激因子注射液治疗，孕60 d胚停育行清宫术，未查绒毛染色体。

2020年3月来我院行第2周期IVF助孕。IVF前BMI 21.3 kg/m2；妇科检查未见明显异常；妇科超声提示：子宫内膜回声均匀，双侧子宫动脉血流阻力正常，双侧卵巢储备卵泡7枚；基础性激素检查：FSH 9.3 U/L、黄体生成素(LH) 3.35 U/L、雌二醇(E2) 109.1 pmol/L、睾酮(T)1.11 nmol/L、孕酮(P)0.98 nmol/L、抗苗勒管激素(AMH) 2.39 ng/ml；生殖免疫检查：ACA IgM(+)IgG(-)、抗β-GP1(-)、ANA(-)、dsDNA(-)、ENA(-)、α-胞衬蛋白(+)、淋巴细胞(-)；糖代谢：OGTT正常；甲状腺功能正常；25羟维生素D正常；肿瘤标志物CA125为8.9 U/ml、CA199为13.67 U/ml。

男方精液常规报告：前向运动精子(PR)31.8%、非前向运动精子(NP)19.7%、不活动精子(IM)48.5%，前向运动精子总数65.99×106个，精子DNA完整性正常。诊断患者为：原发性不孕史、IVF助孕胚停1次、慢性盆腔炎性疾病后遗症（双侧输卵管切除术后）；子宫内膜息肉摘除术后；反复种植失败；梅毒病史。

制定早卵泡期长方案，促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)降调节35 d启动，Gn总量4 025 U，重组HCG 6 500 U扳机，37 h后取卵，获卵8枚；7枚正常受精，形成7枚D3胚胎（4枚I级，2枚II级，1枚III级），全部行囊胚培养形成6枚囊胚(D5：1枚4AB、2枚4BB；D6：3枚4BB)，新鲜周期移植1枚4AB囊胚未孕。第2次来曲唑+HMG诱导排卵方案FET，移植1枚4BB囊胚未孕。

2020年8月解冻剩余4枚囊胚，2枚存活，行植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)，均为整倍体胚胎。2020年11月子宫内膜容受性检查提示容受晚期，同时宫腔镜检查及子宫内膜免疫组化提示慢性子宫内膜炎，予多西环素抗炎治疗14 d后，按照子宫内膜容受性提示时间2次来曲唑+HMG诱导排卵方案FET，移植2枚4BB正常信号囊胚，移植后低分子肝素治疗均未孕。

2021年11月行第3周期IVF助孕。克罗米芬+贺美奇+生长激素微刺激方案IVF，Gn总量525 U、克罗米芬总量175 mg，获卵9枚，7枚正常受精，全部囊胚培养形成4枚囊胚(2枚4BB、2枚4BC），因内膜因素全胚冷冻。2022年1月自然周期FET，移植1枚4BB囊胚，移植后仅常规黄体支持；移植后14 d血β-HCG>1 357 U/L，移植后28 d经B超监测提示宫内早孕，见胎心；2022年9月足月活产一孩，健康，出生体重3 100 g，Apgar评分10分。

讨  论

一、RIF定义

RIF的定义目前尚存在争议。大部分人根据移植胚胎的数目和次数来定义RIF，较常用的标准有：2005年欧洲人类生殖和胚胎学会(European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE)胚胎植入前遗传诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD)联盟提出的“经历3次以上优质胚胎移植或累积移植胚胎数量10枚未获临床妊娠”；2014年Coughlan等提出的“40岁以下不孕患者经历大于等于3个取卵周期，新鲜或冻融移植周期累计至少移植４枚优质胚胎而未获临床妊娠”；2014年Polanski等提出的“经历大于等于2个新鲜周期或冻融周期，共移植不少于4枚优质卵裂期胚胎或者2枚囊胚而未获临床妊娠”；2015年Santillán等提出的“至少尝试3次移植周期且每个周期至少有1枚优质胚胎而未获临床妊娠”等。

本文报道案例中患者2个取卵周期，前后移植8次，共8枚优质卵裂期胚胎+4枚囊胚（其中2枚PGT-A整倍体的囊胚），仅一次胚停育，7次未孕，是一例较为典型的RIF病例。

二、反复种植失败的原因及处理探讨

虽然目前对RIF还没有统一的定义，但是对其可能的病因研究早已成为生殖医学的热点。RIF病因涉及配子、胚胎质量及其发育潜能，以及母体子宫内膜容受性、自身免疫、盆腔环境及代谢等多重因素。目前文献报道的RIF的原因主要包括以下几个方面。

（一）配子/胚胎因素

1.卵母细胞质量：影响卵母细胞质量的因素很多，主要包括年龄、子宫内膜异位症、放化疗史、卵母细胞自身发育缺陷等，甚至促排卵方案及Gn用量也会影响卵母细胞的质量。随着年龄的增长，卵泡数量减少、卵母细胞质量下降，染色体异常和流产的发生率也会随着孕妇年龄的增加而增加。本案例中患者为32岁的健康女性，暂不考虑年龄及放化疗等特殊病史对于卵母细胞质量的影响。

生长激素（growth hormone，GH）是垂体前叶分泌的肽类激素，可提高细胞的能量代谢和增殖能力，促使卵泡细胞FSH、LH受体表达，改善卵泡颗粒细胞的老化状态。有研究表明，GH可提高成熟卵母细胞数量，改善临床妊娠率和活产率，降低原发性卵巢功能减退女性的周期取消率和Gn剂量；对于卵巢储备功能低下、卵巢低反应的患者，GH能够改善卵巢的反应性，提高活产率。本案例在第3次促排卵周期添加GH，其最终的活产结局与相关文献报告相符合。

促排卵方案中Gn用量对卵母细胞质量是否有影响尚存在争议。既往有研究向卵母细胞体外成熟（IVM）培养液中加入不同浓度的FSH，发现高浓度FSH显著增加了第一次减数分裂错误，导致IVM中非整倍体卵母细胞增多，因此大剂量促排卵治疗产生的高FSH以及高雌激素水平可能会影响卵母细胞质量。

2021年一项涉及FSH在卵母细胞发育调节中作用的研究表明，活产与单个卵母细胞的卵泡内FSH水平呈负相关，而与血清FSH浓度呈强正相关，与以往FSH是卵泡和卵母细胞促进剂的观念相反，过度的FSH对卵母细胞稳态和质量具有负面影响。但也有研究表明，外源性Gn用量与囊胚非整倍体率及活产率没有相关性。

微刺激促排卵方案是采用少量促性腺激素药物促排卵进行IVF-ET的一种治疗方案。近年来微刺激方案逐渐被人们接受，较多用于高龄、卵巢低反应的不孕症患者。国际温和方案辅助生殖技术协会(The International Society for Mild Approaches in Assisted Reproduction，ISMAAR)委员会表示所有临床情境下均可以采用微刺激方法，因为越来越多的证据表明微刺激与传统刺激一样有效，而且更安全、更便宜，然而该方案是否能够作为一线促排卵方案应用在卵巢储备功能正常的患者，尚无统一意见。

因此，对于RIF患者促排卵方案的选择，应根据患者的情况进行个性化的选择，Gn对于卵母细胞质量的影响仍有待进一步研究。本案例共进行了3个取卵周期，分别采取了短效长方案、早卵泡期长方案和克罗米芬微刺激方案IVF，最后患者在微刺激IVF移植后成功获得活产，此次受孕可能与微刺激方案Gn用量较少而胚胎质量得以改善有关。

2.精子质量：精子DNA损伤也与胚胎发育情况有关。2019年一项探讨精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)与胚胎形成率关系的研究表明：SDF水平与男性年龄呈正相关，与精子活力呈负相关；在SDF<30.7%的个体中，优质或A级胚胎形成率中位数显著高于SDF≥30.7%的个体，因此男方SDF水平高会导致第3天优质胚胎形成率下降。

2019年另有一项系统综述与荟萃分析研究表明SDF与复发性流产的风险增加有关。因此精子质量对于胚胎质量的影响可能会导致RIF及复发性流产等负面的辅助生殖结局。该病例中男方精子DNA完整性无异常，因此暂可排除精子质量对于RIF的影响。

3.胚胎质量：早在2003年就有研究表明，反复IVF失败的患者胚胎异常率显著高于对照组，对卵裂期胚胎活检+荧光原位交杂（fluorescence in situ hybridization，FISH）检验后进行鲜胚移植，可以改善反复IVF失败患者的妊娠率。因此在胚胎植入前进行胚胎染色体的筛查对于RIF患者有一定的帮助。

目前胚胎植入前非整倍体遗传学检测（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）常选择囊胚期活检，以最大程度降低对于胚胎发育的影响，且将胚胎培养到囊胚阶段也有助于选择种植潜力最优的胚胎。

2019年一项多中心的前瞻性研究表明，RIF患者非整倍体发生率高达78.9%，行PGT-A不增加每RIF患者的活产率，但是可以增加RIF患者每移植周期的活产率。本案例中患者在获得活产前有过1次临床妊娠，但是孕60 d余胚停育流产，当时未行绒毛染色体检查，不能排除该次移植胚胎是非整倍体胚胎的可能性。此患者后移植2枚整倍体核型正常的囊胚未孕，再次说明该患者反复移植失败不单单是胚胎整倍体的因素。

（二）母体因素

1.子宫内膜容受性：母体子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎在子宫腔内进行定位、粘附、侵入等过程的能力。子宫内膜容受性不佳不仅影响胚胎的着床，还会影响胚胎的远期发育和胎盘形成，是RIF的常见原因。母体纵隔子宫、宫腔粘连或占位、盆腔子宫内膜异位症、严重的子宫腺肌症、输卵管积水等生殖系统解剖结构异常均可能与RIF相关。

纠正异常的生殖解剖结构，有助于改善RIF患者的妊娠结局。宫腔镜可以直观评价宫腔状况，判断有无宫腔结构异常、有无子宫内膜炎，同时对部分解剖结构的改变进行矫正，且可留取子宫内膜组织标本进行病理检查，改善胚胎移植的妊娠结局。对于有IVF-ET失败史的患者，宫腔镜检查可以显著提高再次移植的成功率。

2018年一项针对RIF患者宫腔镜检查的荟萃分析提示宫腔镜检查可以改善RIF患者的妊娠结局。本案例中的患者进行了2次宫腔镜检查治疗术，检查提示子宫形态正常，但存在子宫内膜息肉以及子宫内膜炎，进行了子宫内膜息肉摘除+抗感染治疗，排除了子宫内膜解剖结构异常以及子宫内膜炎对于RIF的影响。

子宫内膜容受性检查（endometrial receptivity analysis，ERA）可以个性化调整移植时间，除了通过超声、子宫内膜活检、子宫内膜抽吸液和宫腔镜检查评估确定临床妊娠与各种子宫内膜容受性标志物(子宫内膜厚度、子宫内膜形态、多普勒指数、子宫内膜波浪状活动及各种分子)之间的联系外，随着显微镜、流式细胞术和分子技术的进步，ERA检测将会更准确地判断子宫内膜容受性，以帮助RIF患者获得活产。

本案例患者为了避免胚胎移植窗口的偏移进行了ERA检测，并根据检测结果调整移植时间并移植了2枚正常信号的胚胎未孕，说明该患者种植窗异常不是移植失败的直接原因。

RIF患者进行冻融胚胎移植（FET）时，常采用的内膜准备方案包括自然周期、激素替代周期、促排卵周期、降调节周期等。

2017年一项回顾性分析研究表明，与自然周期内膜准备方案及传统激素替代内膜准备方案比较，3.75 mg GnRH-a降调节激素替代内膜准备方案可提高RIF患者FET周期妊娠率而不增加流产率。然而2018年一项研究表明，FET周期采用此４种子宫内膜准备方案的临床效果相当。

目前FET周期的内膜准备方案孰优孰劣，仍有待进一步研究和确认。需明确的是自然周期IVF和促排卵IVF不是相互竞争的治疗，而是不同目标群体和不同适应证的补充治疗。

本案例患者充分尝试过降调节周期、激素替代周期、促排卵周期及自然周期等内膜准备方案，最终通过自然周期内膜准备方案移植1枚冻融4BB囊胚成功妊娠，但并不能说明其他几种内膜准备方案对于患者是不利的。

2.母体的高凝状态及免疫失调：母体的高凝状态及全身或子宫内膜局部的免疫失调也可能是导致RIF的原因，目前较多采用免疫治疗。对高凝状态及免疫系统的调节和抑制的办法主要包括应用阿司匹林、低分子肝素、某些免疫制剂（如糖皮质激素、环孢素、羟氯喹等），免疫疗法如宫腔内注射自体外周血单个核细胞、静脉注射用人免疫球蛋白、注射粒细胞集落刺激因子等。这些治疗方法被证实可能对改善患者妊娠结局有明显或潜在益处，但目前尚缺乏有力的循证医学证据。

早在1997年就有一项研究表明，应用阿司匹林可以改善子宫内膜厚度和形态，降低子宫动脉搏动指数和阻力指数，增加子宫内膜血流和改善子宫内膜容受性。

然而2018年美国生殖医学会（ASRM）指南中指出阿司匹林、糖皮质激素并未提高妊娠率和活产率，因此不推荐IVF周期中常规使用阿司匹林、糖皮质激素。

2013年一项纳入3个随机对照试验（RCT）的系统综述和荟萃分析研究表明，低分子肝素开始于取卵日或者移植日持续用至孕20周或分娩，能够降低RIF患者的流产率，增加活产率。

然而，2018年一项多中心回顾性队列研究表明，鲜胚移植日开始使用低分子肝素至HCG日，并不能增加RIF患者的鲜胚移植活产率及临床妊娠率，因此不推荐在RIF患者中常规使用。

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）宫腔灌注是目前常见的免疫治疗之一，2020年一项荟萃分析的低等证据表明G-CSF可改善RIF患者的IVF妊娠率。但是也有研究表明免疫治疗在改善IVF助孕女性的活产率和复发性流产等方面并无显著作用，因此免疫治疗尚未常规在临床实践中使用以改善生殖结局。由此可见，免疫治疗对复发性流产及RIF的作用机制、有效性及安全性仍待进一步研究证实。

本案例中患者生殖免疫检查示胞衬蛋白阳性（近年来有研究表明α-胞衬蛋白阳性，对于干燥综合征的诊断有一定的临床意义），发现患者可能存在全身免疫失调问题时，予口服羟氯喹、阿司匹林、泼尼松治疗；2019年6月第4次胚胎移植（激素替代周期FET）中移植了2枚D3胚胎妊娠，移植后予低分子肝素、G-CSF治疗，患者仍胚胎停育而失败。虽然免疫治疗后患者第1次FET妊娠未获得活产，但是并不能说明免疫治疗对于案例中的患者无效。

3.盆腔环境异常：输卵管积水是造成RIF的常见原因之一。输卵管积水可能对精子活力和胚胎有直接的毒性作用，输卵管内液体的增加也可能导致子宫内膜容受性异常。输卵管积水还可影响HOXA10基因的表达，该基因在指导胚胎发育和植入中起着至关重要的作用，输卵管积水患者行输卵管切除术后，其子宫内膜恢复表达HOXA10。输卵管积水患者行输卵管切除术可以提高胚胎种植率，改善RIF患者的IVF结局。

子宫内膜异位症患者的慢性子宫内膜炎症一定程度上可破坏子宫内膜容受性，从而导致子宫内膜异位症患者的子宫内膜对胚胎着床的接受程度较低，因此子宫内膜异位症患者发生RIF的概率也会升高。

本案例中患者IVF助孕前检查提示输卵管积水并进行了腹腔镜下双侧输卵管切除术，术中未见到子宫内膜异位病灶，CA125数值正常，因此术后一定程度上可以排除输卵管积水以及子宫内膜异位症对于后续RIF的影响。

4.代谢异常：2016年的一项研究发现，与IVF-ET助孕成功的女性相比，RIF患者的脂质代谢、精氨酸代谢和能量代谢等有关代谢物质均发生显著性变化。因此可见，代谢相关的内分泌疾病可能会对胚胎质量有一定的影响，从而影响胚胎着床，而参与这些代谢通路中的相关分子对RIF具体影响的机制仍待进一步研究。母体患有糖尿病、甲状腺功能异常等疾病，或过度肥胖、代谢紊乱都可能导致RIF。本案例中患者BMI在正常范围内，糖耐量试验、甲状腺功能以及25羟维生素D等内分泌相关的检查均在正常范围内，因此暂可排除其由于母体代谢异常导致RIF。

三、总结

本案例中对患者的RIF进行了多方面的分析与讨论，并对已发现可能造成RIF的原因进行纠正后仍未达成活产结局，最终通过微刺激方案与自然周期FET获得活产，推测微刺激方案减少Gn用量提高胚胎质量可能是原因之一，但是尚缺乏证据支持。此外，患者前期所做的针对RIF的治疗，可能也是最终获得成功妊娠的铺路石。

该病例提示我们，虽然目前缺乏更多的病例支持，对于不明原因RIF，或针对RIF纠正相关因素后仍不能成功的案例可尝试微刺激方案。至于微刺激方案IVF在RIF人群可能的作用及机制期待更多的病例数据支持，且目前仍需进一步从基础和临床两方面对RIF的机制和处理措施做更深入的研究。

文章来源：

赵飞燕，高彦，胡艳秋，等.反复种植失败患者微刺激方案IVF-ET助孕成功一例及文献复习[J].生殖医学杂志，2023,32(9):1363-1368.