中科大/合工大/安医大AFM：生物启发型低放热注射式聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于治疗骨髓炎！

随着骨疾病的增多，骨替代生物材料已成为骨再生治疗策略中迫切需要并被认可的有效方法。然而，不当的机械性能、不可控的固化时间以及放热热限制了其临床应用。在此，合肥工业大学殷俊&安医一附院周健&安医大口腔医学院祝心威构建了一种由聚甲基丙烯酸甲酯、羟基磷灰石、姜黄素、氧化海藻酸钠和聚乙烯亚胺组成的易于制备的可注射骨水泥。利用酸碱和H₂O₂响应性共价键的优点，所得骨水泥不仅具有卓越的压缩强度(>70 MPa)、弯曲强度(>50 MPa)、适宜的固化时间(9–14分钟)和低放热(<42 °C)，而且还能在接受骨髓炎微环境触发时释放药物。在细胞水平和大鼠骨髓炎模型中，所制备的骨水泥展现出优异的生物相容性（细胞存活率：>97%；溶血比率：<1.8%）、抗菌性（最低细菌存活率：≈1.7%）、抗炎性（iNOS、CD86、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著受到抑制）以及促进骨再生的能力（成骨细胞增殖和抑制破骨细胞）。相信本项工作将为骨组织工程提供一种生物活性有机/无机复合材料，其独特的人性化低放热特性和前药技术整合的多功能集成优势赋予其潜在的临床应用前景。该研究以题为“Functionalized Hydroxyapatite and Curcumin Incorporated Stimuli-Responsive Low-Exothermic and Injectable Poly(methyl methacrylate) Bone Cement for the Treatment of Osteomyelitis”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

方案1描述了制备生物启发型Janus骨水泥的合成路径和治疗慢性骨髓炎的机制。首先，通过特定的化学反应合成了氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰的羟基磷灰石(HA)和姜黄素(Cur)@HA，这些组分利用其酸和过氧化氢(H₂O₂)响应性的共价键与氧化的海藻酸钠(OSA)及支链聚乙烯亚胺(PEI)交联，形成有机/无机复合物。这一复合物随后与PMMA预聚物以不同的摩尔比例混合，制备出可注射的双组分骨水泥前体，该前体能够在注射到骨缺损部位后进一步固化。方案1展示了这种骨水泥的制备流程和作为治疗慢性骨髓炎的多功能集成应用的潜力，包括微环境响应性药物释放和调节炎症因子，以及促进成骨表现的能力。研究者相信，这种材料的开发为骨组织工程提供了一种新的活性有机/无机复合材料，具有低放热、优异的生物相容性和多功能性，展现出潜在的临床应用前景。

方案1. 有机-无机复合材料OSA/PEI/APTES/Cur@HA组分的合成路线，以及制备功能性聚合物和HA改性PMMA骨水泥的示意图

【PMMA水泥的合成与表征】

图1展示了基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的骨水泥的注射性和成型能力，以及纯PMMA和含羟基磷灰石（HA）的PMMA骨水泥的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线光电子能谱（XPS）分析结果。数字照片显示，新鲜混合的骨水泥浆料能够轻易从注射器中挤出并保持连续状态，证实了其优秀的注射性和成型性，适合用作复杂骨空间的填充材料。FT-IR光谱证实了HA成功掺入PMMA基质中，XPS分析进一步确认了HA、OSA和PEI的存在，EDS（能量色散光谱）映射显示Ca、P和C元素在PMMA中均匀分布，证实了固体和液体相的成功混合。因此，通过将固体HA衍生物掺杂到纯PMMA骨水泥中，能够有效降低其机械强度并提升弹性，使其更适应骨填充部位的需求，并在保持所需机械强度的同时减少术后再骨折的风险。

图1. PMMA水泥的合成与表征

【设定时间和放热温度】

图2展示了不同PMMA骨水泥的固化时间、放热温度、压缩强度、弹性模量和弯曲强度。研究发现，随着PMMA含量的降低，所有样品的固化时间延长，从9到14分钟不等，且PMMA含量和比例对固化时间有明显的依赖性。在固化过程中，PMMA骨水泥的放热温度逐渐上升，但最高温度远低于纯PMMA，且低于ISO-5833标准规定的90°C，表明新型骨水泥具有较低的放热，有利于保护周围组织。此外，压缩强度、弹性模量和弯曲强度随着PMMA含量的减少而降低，但仍满足ISO 5833标准要求的最低值。这表明通过调整PMMA含量和比例，可以在保持所需机械性能的同时，改善骨水泥的生物相容性和操作性能。

图2. 设定时间和放热温度

【润湿性和降解性】

图3探讨了PMMA骨水泥的表面亲水性、吸水率以及降解率。实验结果显示，随着PMMA含量的降低，所有样品的接触角减小，表明亲水性增强，有利于提高骨水泥与骨组织的整合性。吸水率测试表明，亲水性聚合物的加入导致PMMA骨水泥在模拟体液(SBF)中的吸水率增加，这有助于减少固化后体积收缩的问题。降解率测试显示，在pH 7.4和5.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中浸泡7天和14天后，所有样品的降解率均较低，表明通过化学交联增强了PMMA骨水泥的结构完整性。因此，通过调节PMMA含量和亲水性聚合物的加入，可以平衡骨水泥的亲水性、吸水率和降解率，以满足临床应用的需求。

图3. 润湿性和降解性

【地表形态】

图4通过扫描电子显微镜(SEM)观察了PMMA骨水泥在模拟体液(SBF)中浸泡前后的表面形貌变化。结果显示，纯PMMA骨水泥表面在浸泡14天后仍然保持光滑，没有显著变化。相比之下，掺杂了亲水性聚合物的PMMA骨水泥(C_0.4H_0.8@P_x和C_0.3H_0.77@P_y)表面则由光滑变为粗糙，并出现了许多穿透的孔洞结构。这种表面粗糙化和孔洞结构的增加有助于促进封装治疗分子的释放和骨细胞的增殖。然而，过多的孔洞结构可能会影响骨水泥的机械性能。综合考虑结构和机械性能之间的关系，选择了C_0.4H_0.8@P_0.9/_0.86和C_0.3H_0.77@P_0.9/0.86四个样品进行进一步研究。结论是，通过调整PMMA骨水泥的组成，可以在一定程度上调控其表面形貌，优化其生物学性能，同时保持必要的机械强度。

图4.地表形态

【体外药物释放】

图5研究了PMMA骨水泥在不同条件下姜黄素的释放行为、DPPH自由基清除能力。实验观察到，所有PMMA骨水泥样品在最初的24小时内都有姜黄素的突释现象，随后是持续较慢的释放过程，持续至168小时（7天），最大释放率分别达到65.5%和70.1%，显示出比其他辅助掺杂样品更高效的药物释放。在pH 5.5和200 μM H₂O₂条件下的释放率比仅含200 μM H₂O₂条件下的释放率高，这归因于pH诱导的希夫碱键断裂和H₂O₂诱导的草酸盐键解离的协同效应。DPPH实验表明，所有样品均展现出良好的抗氧化能力，随着时间的推移，清除率逐渐增加。特别是C_0.4H_0.8@P_x组的清除率显著高于C_0.3H_0.77@P_y组，尽管其释放率较低，但由于C_0.4H_0.8@P_x组中姜黄素的含量更高，因此具有更高的清除浓度和ROS清除能力，进一步抑制了ROS诱导的炎症状态。此外，在正常中性环境下（无酸或H₂O₂），PMMA骨水泥几乎不释放姜黄素。因此，通过特定的化学修饰和掺杂，PMMA骨水泥可以实现对姜黄素的控释，以及具有抗氧化性能，有助于促进骨髓炎的恢复。

图5. 体外药物释放

【生物相容性】

图6评估了PMMA骨水泥的生物相容性和体外抗菌效果。生物相容性测试显示，与骨髓来源的巨噬细胞共培养24小时后，细胞存活率高，表明骨水泥样品对细胞无毒性。溶血试验结果表明，骨水泥样品处理的红细胞溶血比率远低于国家标准，显示出良好的血液相容性。抗菌测试结果揭示，特别是C_0.4H_0.8@P_0.86组，PMMA骨水泥显著降低了MRSA的存活率，证实了其出色的抗菌性能。

图6. 生物相容性

【抗炎】

图7研究了PMMA骨水泥对巨噬细胞炎症反应的影响。实验中，RAW264.7细胞与PMMA骨水泥共培养，并用脂多糖(LPS)诱导M1型巨噬细胞的产生。通过免疫荧光染色检测诱导后iNOS的表达，结果显示PMMA骨水泥显著降低了iNOS的荧光强度，表明其能有效抑制iNOS的产生，减少炎症。此外，通过逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析了iNOS、CD86、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的mRNA表达水平，发现PMMA骨水泥处理的细胞中这些炎症因子的表达显著受到抑制。西方印迹(Western blot)检测进一步证实了iNOS和CD86蛋白表达水平的降低。这些结果表明PMMA骨水泥具有显著的抗炎作用，能够减少LPS刺激引起的炎症因子表达，从而在治疗骨髓炎时可能有助于缓解炎症反应。

图7. 抗炎 

【成骨细胞和破骨细胞分化分析】

图8通过碱性磷酸酶(ALP)染色和定量检测，观察到PMMA骨水泥组特别是C_0.4H_0.8@P_0.86和C_0.3H_0.77@P_0.86组，与对照组和纯PMMA组相比，显示出更明显的成骨细胞增殖和ALP活性增强。Alizarin Red S (ARS)染色也表明这些组具有更好的生物矿化能力。通过Western blot技术检测成骨标志物Runx2和Col-1的蛋白表达水平，结果显示PMMA骨水泥显著提高了这些蛋白的表达量，证实了其促进骨形成的巨大潜力。另一方面，通过酸性磷酸酶(TRAP)染色检测了PMMA骨水泥对破骨细胞增殖的抑制作用，发现PMMA骨水泥能显著减少TRAP阳性破骨细胞的数量，并且随着PMMA骨水泥中姜黄素含量的增加，抑制效果更为明显。此外，通过qRT-PCR分析了破骨细胞相关因子的表达水平，包括Ctsk、c-Fos和NFATc1，C_0.4H_0.8@P_0.86组显示出最大的抑制比例。这些结果表明PMMA骨水泥不仅促进了成骨细胞的分化和矿化，还有效抑制了破骨细胞的生成，从而在骨组织修复和再生方面展现出了积极的潜力。

图8. 成骨细胞和破骨细胞分化分析

【显微计算机断层扫描（Micro-CT）分析】

图9通过微计算机断层扫描(micro-CT)分析评估了PMMA骨水泥在大鼠胫骨骨髓炎模型中的治疗效果。结果显示，与仅注射MRSA的空白对照组和纯PMMA组相比，治疗组C_0.4H_0.8@P_0.86和C_0.3H_0.77@P_0.86显示出显著的骨修复效果。经过两个月的治疗，这些治疗组的大鼠胫骨仅留下微小的缺陷，而对照组则显示出明显的骨损伤。定量分析表明，治疗组的骨密度、新骨体积与组织体积比、以及小梁厚度均显著高于对照组，而小梁间隙则显著减少。此外，通过观察大鼠的组织切片，确认了PMMA骨水泥在治疗部位的姜黄素没有对周围健康组织产生显著影响。这些结果表明，所开发的PMMA骨水泥在体内具有优异的抗菌和骨修复能力，同时具有较低的放热，对周围组织安全，展现出在骨组织替代工程中应用的巨大潜力。

图9. 大鼠慢性骨髓炎模型的治疗

【小结】

该研究制备了一种新型的微环境响应型可注射聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）基骨水泥，通过掺杂羟基磷灰石（HA）、姜黄素（Cur）、氧化海藻酸钠（OSA）和聚乙烯亚胺（PEI），实现了优异的塑形性、符合ISO 5833标准的机械性能、生物相容性、抗菌和抗炎性能。这种骨水泥的突出特点是低放热（<42 °C），接近人体温度，能最大限度地保护健康组织。通过2D微CT和3D重建技术，证明了该骨水泥在2个月内促进了快速骨再生。研究结果为制备具有生物活性的骨填充材料提供了新策略，这些材料能够充分满足临床需求，在保护患者的同时缩短治疗过程。尽管该工作在制备新型多功能骨水泥材料方面取得了显著进展，尤其是降低了固化温度，使现场填充和成型更加患者友好，但当前设计的主要缺点是组分数量多且需要现场化学反应。这将激励我们未来持续开发组成更少、能在更温和环境中有效治疗骨疾病的新一代骨填充材料。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202406817