靶向肿瘤免疫微环境：TLR9激动剂的联合免疫疗法

前言

在过去的十几年中，以免疫检查点抑制剂（ICI）为代表的免疫治疗取得了重大的临床突破。到目前为止，靶向PD-1\PD-L1和细CTLA-4的ICI已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于临床治疗。这些免疫疗法有效地提高了癌症患者的生存率和生活质量。然而，由于肿瘤的复杂异质性，检查点抑制剂对实体瘤的反应率仅为20%-30%，大多数肿瘤对ICI治疗仍然不敏感。

肿瘤通常分为“热”肿瘤或“冷”肿瘤表型。“热”肿瘤根据肿瘤微环境（TME）中细胞毒性淋巴细胞（CTL）的高度浸润进行分类。这种肿瘤通常对免疫疗法反应良好。相比之下，“冷”肿瘤的免疫原性较差，其特征是淋巴细胞浸润较低，缺乏预先存在的肿瘤特异性T细胞反应。为了提高免疫疗法的疗效，需要新的联合疗法将非炎症的“冷”肿瘤转化为炎症微环境，并增加CTL的浸润。

Toll-like receptor 9（TLR9）激动剂在治疗癌症的单一疗法或联合疗法中已被广泛研究。TLR9激动剂在联合疗法中可以与其他疗法协同增效，增强抗肿瘤免疫反应。研究发现，TLR9激动剂激活B细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC），增加TH1促进趋化因子和细胞因子的释放，从而改善肿瘤抑制微环境，促进T细胞介导的免疫反应。TLR9激动剂与癌症抗原疫苗、放射疗法、化疗和免疫疗法的联合使用已在几种动物模型和临床试验中进行了研究，显示出巨大的潜力。

TLR9及其激动剂

Toll样受体的发现是免疫学的里程碑之一。TLR是一种高度保守的模式识别受体（PRR），可以识别各种类型的微生物病原体相关模式分子（PAMP）。TLR受体家族包含六种跨膜TLR（TLR-1、2、4、5、6和10）和四种定位于内涵体膜的TLR（TLR-3、7、8和9）。每种PAMP都被不同的TLR识别，即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2与TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、单链RNA（TLR7/8）、双链RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。

根据化学结构和生物学活性，CpG-ODNs可分为 A，B 和 C 3种类型。B 型 CpG是发现最早、研究得最清楚的类型。它由一个或多个CpG基序组成，通常位于硫代磷酸酯骨架上。与天然磷酸二酯酶核苷酸相比，这种主链增强了对核酸酶消化的抵抗力，为其提供了更长的体内半衰期（30–60分钟，而磷酸二酯酶为5–10分钟）。B型CpG触发pDC分化并产生TNF-α，并刺激B细胞增殖和分泌IgM。

A 型 CpG以含有CpG 二核苷酸的回文序列为核心，两端为 poly G尾，磷酸二酯键骨架为部分硫代修饰。这类 CpG通过回文序列和 poly G 形成高级结构，能够活化 pDC 诱生大量 I 型干扰素，但对B细胞活性很弱。B型CpG与A型CpG的不同活性很大程度上是由于CpG/TLR9复合物在pDC内体中的保留时间不同。B型CpG通过早期内体快速转运到晚期内体，而A型CpG在早期内体中保留的时间更长。

C型CpG在完全由硫代磷酸核苷酸组成方面类似于B型，但在包含回文CpG基序方面类似于A型，因此可以形成茎环结构或二聚体。它兼具 A 和 B 型 CpG的活性，既能活化pDC，又能活化 B 细胞。

CpG-ODN和ICI联合疗法

TLR9激动剂与抗PD-1的协同效应也已在多种小鼠肿瘤模型中得到验证，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和淋巴瘤。在免疫原性B16/OVA黑色素瘤模型中，CpG1826与抗CTLA-4的组合导致双侧肿瘤减少，这与肿瘤抗原特异性T细胞浸润增加以及Tregs和炎性细胞因子减少有关。此外，在非免疫原性B16/F10黑色素瘤小鼠模型中，瘤内注射CpG-ODN1826联合抗PD-1或抗CTLA-4治疗对肿瘤的治疗侧也有效，但未注射的肿瘤很少消退。随着对CpG-ODN机制的深入研究，发现肿瘤内给予CpG-ODN增加了Treg细胞中OX40共刺激受体的表达，瘤内注射SD-101和抗OX40抗体成功保护了自发性乳腺癌小鼠，具有良好的治疗效果。

Vidutolimod（CMP-001）是一种CpG-a寡核苷酸，包装在由噬菌体外壳蛋白Qβ形成的病毒样颗粒内。在最近公布的一项1b期临床研究（NCT02680184）中，评估了肿瘤内注射Vidutolimod联合pembrolizumab的疗效和安全性，显示出克服晚期黑色素瘤患者的PD-1抑制剂耐药性的潜力。

在本研究的剂量递增阶段，有44名曾接受抗PD-1治疗的晚期黑色素瘤患者入组。44名患者中有11名（25%；95% CI，13%–40%）在使用RECIST v1.1的疗效评估标准进行评估时获得PR或CR，其中4名CR，7名PR。在有响应的患者中，每个受试者的平均反应持续时间（DOR）为19.5个月，包括5例反应>23个月的患者。中位缓解时间为2.5个月，中位无进展生存期（PFS）为2.8个月（95% CI, 2.7-5.4）。

HP007为华普生物技术公司自主开发的新型C型CpG。今年在美国圣地亚哥举行的美国癌症研究协会（AACR）2024年年度会议报告中，HP007联合PD-1抗体、CTLA-4抗体和CD40激动性抗体在转移性去势耐受性前列腺癌患者中表现出卓越的临床反应。在13名可评估的患者中，12人出现了客观响应，其中6人CR，6人PR，总响应率（ORR）达92.3%。在数据分析时，另外两名可评估的患者病情稳定。6名患者出现轻度至中度治疗相关不良事件，包括发烧、僵硬、疲劳、发汗、血尿、尿路感染、急性尿潴留和肝酶升高。

CpG-ODN和肿瘤疫苗

作为TLR激动剂，CpG-ODN是肿瘤疫苗中使常用的佐剂之一。针对各种类型的肿瘤，如淋巴瘤（NCT00490529）、黑色素瘤（NCT00145145、NCT00112242、NCT00471471、NCT00112242）、非小细胞肺癌（NCT00199836）和前列腺癌（NCT00292045），多个使用CpG-ODN的肿瘤疫苗临床试验正在进行中。

此外，材料科学的发展极大地促进了肿瘤疫苗的进步。一种2'3'-CGAMP、CpG-ODN和抗原性肽纳米多孔微粒（μGCVax）的组合，在小鼠模型中有效抑制肺转移性黑色素瘤、原发性乳腺癌和结直肠癌。最近的一项研究报告称，AIRISE-02（包封CpG-ODN1826和STAT3 siRNA的纳米颗粒）与PD-1和CTLA-4联合使用，该组合在多种肿瘤模型中取得了显著成果，原位肿瘤和远端肿瘤均消退，63%的黑色素瘤小鼠完全治愈，这种抗肿瘤作用也具有免疫记忆。

CpG-ODN和其它激动剂

触发多种PRR的新策略，包括使用特定激动剂的不同TLR和STING，已被证明可以同时激活多种信号通路，为肿瘤疫苗产生强有力的免疫反应。CpG-ODN和3M-052（TLR7/8激动剂）、CpG-ODN和STING，以及TLR3激动剂Poly（I:C）和CpG-ODN的组合已在各种动物模型中进行了评估，如黑色素瘤和ErbB2+乳腺癌等。CpG-ODN加Poly（I:C）的气雾剂递送已被证明能有效治疗C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤肺转移。此外，当TLR9激动剂与其他激动剂联合用于肿瘤治疗时，给药顺序也很重要，需要探索相关机制。

CpG-ODN和放射治疗

几十年来，放射治疗（RT）一直是癌症患者常规治疗的重要组成部分。放疗除了直接杀死肿瘤细胞外，还可以引发免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤抗原并产生炎症效应。在肿瘤细胞中发生ICD后，它们会释放一系列损伤相关分子模式（DAMP），这些模式促进APC成熟并激活CTL杀死肿瘤细胞。当TLR9激动剂被添加到肿瘤微环境中时，它可能会进一步增强APC的激活，并促进来自肿瘤细胞的抗原通过MHC I类分子的交叉呈递，通过CD8+T细胞反应杀死肿瘤组织。评估TLR9激动剂和RT组合的几项临床前研究表明，它们在免疫反应性小鼠肿瘤模型中具有协同作用。

CpG-ODN和化疗

化疗药物也是肿瘤治疗的传统药物之一，除了引起肿瘤细胞的ICD外，它还改变了肿瘤微环境，增加了肿瘤浸润的T细胞和NK细胞，诱导M2巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞，减少了Treg和MDSC等免疫抑制细胞的数量。

最近的一项研究表明，联合注射CpG-ODN、α-OX40和蒽环类药物完全消除了局部和远处的4T1乳腺癌，没有显著复发。阿霉素和CpG-ODN自交联纳米粒子（CpG-ODN-NP）通过水凝胶递送给小鼠，显示出协同抗肿瘤作用。研究还将伊布替尼与CpG ODN联合使用，并在淋巴瘤小鼠模型中取得了良好的抗肿瘤效果。然而，在实际应用中，还应该关注化疗的细胞毒性和骨髓抑制作用，如何平衡有效性和安全性仍然是一个关键问题。

小结

由于肿瘤发生和发展的复杂性，多种因素可能会限制单一免疫疗法在实体瘤中的疗效。为了克服这种局限性，可能需要针对肿瘤免疫的多个步骤，同时将多种药物一起应用以实现肿瘤的完全消除。TLR9受体激动剂CpG-ODN通过改善免疫微环境，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，与其他疗法联合使用可以提高抗肿瘤效果并减少副作用。目前，TLR9激动剂和肿瘤免疫检查点抑制剂联合已经在肿瘤免疫治疗中展现出巨大的潜力。随着纳米技术的发展，在药物设计中使用不同的材料也有望提高靶向性和治疗效果。最后，为了达到理想的治疗效果，我们还应该加强每种药物的基础研究，只有深入了解其潜在的作用机制，才能取得更好的治疗效果。

参考文献

1.Overcoming PD-1 Blockade Resistance WithCpG-A Toll-Like Receptor 9 Agonist Vidutolimod in Patients With MetastaticMelanoma. Cancer Discov. 2021 Dec 1; 11(12): 2998–3007.

2. AACR News Release：A Biologic Drug-Device Combination Immunotherapy Shows Promise for Patients with Metastatic Prostate Cancer. April 7. 2024

3. Toll-like receptor 9 agonists and combination therapies: strategies to modulate the tumour immune microenvironment for systemic anti-tumour immunity. Br J Cancer.2022 Nov;127(9):1584-1594.

4. Recent progress concerning CpG DNA and its use as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines. 2014 Feb; 13(2): 299–312.