CAR-T治疗实体瘤设计策略解析
2019-10-09 挑食的免疫喵 闲谈Immunology
免疫蛋白质组学发现肿瘤相关抗原（TAAs）。这些抗原可能是完全未知的蛋白质(新抗原)或从野生型突变的肽(新表位)。利用蛋白质组学鉴定的TAAs的几个例子包括PSMA1、PAP3、ANXA3和MASPIN，这几个标记被一组鉴定为结肠癌的生物标志物。其他具有潜在靶向性的TAAS包括olfactomedin4、CD11b和整合素α-2，它们在结直肠癌肝转移中被发现过度表达。
通过肿瘤特异性抗原/肿瘤相关抗原识别肿瘤
利用NGS及蛋白质组学发现更多特异性的肿瘤抗原（TAAs/TSAs）
免疫蛋白质组学发现肿瘤相关抗原（TAAs）。这些抗原可能是完全未知的蛋白质(新抗原)或从野生型突变的肽(新表位)。利用蛋白质组学鉴定的TAAs的几个例子包括PSMA1、PAP3、ANXA3和MASPIN，这几个标记被一组鉴定为结肠癌的生物标志物。其他具有潜在靶向性的TAAS包括olfactomedin4、CD11b和整合素α-2，它们在结直肠癌肝转移中被发现过度表达。
肿瘤抗原也可以通过DNA或RNA测序或整个外显子筛选来识别肿瘤中的体细胞突变。一项对黑色素瘤样本进行整个外显子测序的研究发现，8例患者中有5例存在多个突变表位，9个新表位中有8个T细胞克隆存在。另一项研究利用全基因组测序来鉴定多形性胶质母细胞瘤(Gbm)样本中的体细胞突变，并在所有5名研究患者中发现新表位特异性肿瘤浸润淋巴细胞。最近在一项对PDA患者的长期研究中使用了用于肿瘤抗原预测的整个外显子序列，作者发现，更多的新抗原，加上更多的CD8 TILs，与提高生存率相关。许多对长期存活者具有持久免疫原性的新抗原包含肿瘤相关的MUC16抗原；随着转移的进展，MUC16克隆消失，表明这些新抗原的丢失在肿瘤的进展和转移中起着重要作用。
CD 40激动剂增强T细胞对实体肿瘤的免疫力(CD40在树突状细胞和其他抗原提呈细胞(APC)上表达，并与T细胞上的CD40配体结合以刺激免疫反应。使用CD40激动剂增强T细胞对弱免疫原性肿瘤抗原或冷肿瘤的反应。
肿瘤抗原异质性和解决
实体肿瘤往往表现出很大程度的抗原异质性。许多肿瘤只有一部分细胞表达靶抗原。即使在一致表达的TAA的背景下，也存在着抗原丢失或抗原逃逸的可能性，在这种情况下，目标抗原从存活的肿瘤中消失。CAR-19T细胞转移后，CD19阴性复发证实了这一点。准确机制尚不清楚。一项研究发现了一种剪接突变，导致CD19的变异表达，缺失了CD-19CAR所针对的特定表位。
回路或串联CARS识别两种抗原，以解决抗原异质性和抗原丢失的威胁。这种双CARs已进入针对CD 19/CD 20和CD19/CD22的血液系统恶性肿瘤的临床试验（NCT03241940)。对于实体肿瘤，HER2和MUC1特异性的CAR在乳腺癌模型中具有良好的体外效果，而针对HER2和IL-13Rα2的双靶点CAR在异种移植胶质瘤模型中表现出比单靶点CAR更大的成功。
抗原异质性相关的还有抗原表位扩展，这种现象使以前中枢耐受的抗原的一个不同表位，转变成为T细胞的靶点。CAR-T细胞治疗时，即使肿瘤最初没有靶向抗原表达，CARs对某些细胞裂解可以释放肿瘤特异性肿瘤抗原或抗原表位。这些抗原或表位将由APC处理并呈现给TILS，以诱导对肿瘤的二级免疫应答。在黑色素瘤中发现了表位扩散的证据，在接种黑色素瘤抗原(MAGE)后发现了肿瘤新抗原的反应性。
进一步了解和诱导抗原表位的扩展对增强CAR-T细胞的有效性具有重要的意义，尤其是在高异质性、低突变负荷和有抗原逃逸现象的病例。
其他抗原及安全性问题
为了与T细胞结合，必须在细胞表面表达靶抗原。然而，只有约1%的细胞总蛋白在细胞表面表达，这意味着大量潜在的肿瘤靶抗原无法呈递给CART细胞。
最近，一些临床研究打开了利用CART细胞靶向细胞内抗原的大门，在一项体内骨髓瘤研究中，CAR/TCR混合反应在HLA-A2背景下识别抗原NY-ESO-1，取得了成功。这些TCR-CARs被证明能有效地结合HLA-A2 T细胞。识别MHC结合的TCR-CARS可以像野生型或改良TCRs那样识别胞外抗原和细胞内抗原。
现在使用的肿瘤抗原多数缺少特异性，也称之为肿瘤相关抗原（TAAs），增加了非肿瘤毒性的潜在风险。2010年Morgan等报道一例转移性结肠癌患者接受了针对HER 2抗原(ERBB2)的CART细胞输注，5天后死亡，导致死亡的原因是肺部上皮细胞HER2含量较低，受到CAR-TS攻击。2018年Richman等报道另一个目标脱靶毒性的例子是对神经母细胞瘤具有高亲和力的抗GD2-CAR，其中脑中GD2的低水平导致致命性脑炎。这些灾难性事件强调了寻找安全的TAA的重要性。基于NGS等技术，寻找肿瘤新生抗原等肿瘤特异性抗原（TSA）也成为CAR-T等设计的考量重点。适宜的结合力，而非高结合力和与CAR-T的安全性和有效性相关。
自杀基因是与CAR结构协同表达，是安全性控制的一个重要技术。
自杀基因对于提高CAR-T细胞的安全性是不可或缺的，特别是在他们进入临床试验的时候。这些基因包括诱导型caspase 9(iC9)和截短的EGFR(tEGFR或EGFRt)，它们可触发抗体介导的细胞死亡，以及单纯疱疹病毒胸苷酸激酶(HSV-tk)，后者破坏DNA复制，并通过Fas介导的细胞死亡诱导细胞凋亡。
CAR-T需要突破一系列屏障进入实体瘤
即使确定了实体肿瘤的靶抗原，CAR-T细胞也必须跨越多个障碍才能到达肿瘤部位。趋化因子受体错配可以阻止移行淋巴细胞遵循趋化梯度；内皮细胞上的选择素(Selectins)等表面标记物与循环淋巴细胞结合，并诱导信号级联，以便随后向炎症部位外渗是必要的；T细胞表达相应受体也是必要的。此外，肿瘤相关成纤维细胞(CAFS)和肿瘤部位血管异常等物理屏障也可以阻止T细胞进入。
趋化因子梯度建立
高内皮静脉(HEVS)，被认为是T细胞浸润的关键，在黑色素瘤等癌症中与肿瘤消退有关。然而，这些血管在许多实体肿瘤中都是扭曲和不成熟的，尤其是在肿瘤的核心部位，所以发现的肿瘤浸润淋巴细胞最少。针对VEGF、CD276或内皮素b受体的抗血管生成疗法已被证明可使肿瘤血管正常，并可与CAR-T细胞等靶向治疗结合使用，以增加肿瘤浸润。值得注意的是，一项对黑色素瘤病变进行qPCR的研究发现，高HEV密度与已知的趋化因子编码基因数量呈正相关，这些基因包括CCL 2、CCL 5、CXCL9-13、CCL19和CCL 21。在结直肠癌中，CXCL9、10和11的表达与CD8和CD4TILs的存在及术后生存呈正相关。
鉴于趋化因子在淋巴细胞迁移和归巢中的重要作用，人们采用不同的方法将趋化因子通过瘤内传递来吸引TIL。一项研究使用痘苗病毒将趋化因子CXCL11在皮下MPM小鼠模型中传递，并观察到静脉注射mesothelin-CART细胞后T细胞浸润水平和抗肿瘤效果显着增加。同一组人还开发了一种CXCL11/mesothelin-CAR，它能提高肿瘤内CXCL 11的水平，但并没有提高抗肿瘤活性。研究人员推测，这是由于慢性趋化因子分泌导致T细胞功能低下和/或CXCL11对周围环境的抗血管生成作用所致。然而，另一项mesothelin-CART细胞的研究显示细胞因子IL-7和趋化因子CCL19在实体瘤小鼠模型中完全消退并延长存活时间。研究还显示，CAR-T细胞注射前的淋巴耗竭降低了疗效，提示IL-7和CCL19也吸收了内源性抗肿瘤药物。CAR-T细胞也被转导以表达趋化因子受体，并取得了有益的效果。
成纤维细胞活化蛋白
另一种增强CAR-T细胞浸润肿瘤的方法是开发一种针对FAP(成纤维细胞活化蛋白)的CAR靶向蛋白，该蛋白在几乎所有上皮性肿瘤相关的基质细胞上表达。FAP在胰腺导管腺癌(PDA)和其他类型的肿瘤中扮演着上皮间充质转换(EMT)的角色。在一项研究中，人MPM肿瘤标本和成纤维细胞标本免疫组化显示FAP阳性，FAP CAR-T细胞在体外对MPM细胞有效的杀伤作用。同样的CAR-T细胞抑制肿瘤生长，延长免疫缺陷小鼠腹腔移植瘤的存活时间。
然而，另一项研究表明，FAPCAR在采用多种肿瘤类型的同基因小鼠模型中效果甚微，并观察到致命性毒性，这归因于FAP在骨髓来源干细胞(BMSCs)上的表达。
肿瘤局部注射
一种完全绕过T细胞归巢障碍(并有可能避免非肿瘤毒性)的方法是区域/局部CAR-T细胞注射，这种方法已经在不同程度上成功的实体肿瘤患者中进行了测试。对转移性乳腺癌患者进行的一个0期临床研究表明，肿瘤内注射c-met CAR-T细胞是安全的，并导致肿瘤细胞死亡，并显示了其他抗肿瘤炎症的迹象，包括巨噬细胞募集。
最近，在一项利用人乳腺癌脑转移的异种移植小鼠模型的研究中，颅内和瘤内注射HER2特异性的CAR-T细胞显示，与静脉给药相比，抗肿瘤活性提高，即使在肿瘤复发后，也能完全根除肿瘤并100%存活。另一项研究表明，HER2-BBζCAR-T细胞的区域传递清除了NSG小鼠的髓母细胞瘤，所需剂量明显低于静脉给药。一项使用CEA-CAR治疗腹膜癌(结直肠癌转移到腹腔)的小鼠研究表明，区域腹腔内(IP)注射比静脉注射产生更好的抗肿瘤反应，即使在肿瘤复发和远端肿瘤部位也是如此。最后，用pan-erbB/il-4 CAR-Tt细胞在SCID小鼠体内给药，结果显示所有小鼠肿瘤消退或治愈。
CAR-T肿瘤微环境中存活才能发挥抗肿瘤活性
适应肿瘤微环境糖代谢
CAR-T细胞进入实体肿瘤微环境，战斗还远未结束，大量研究显示肿瘤微环境(TME)对T细胞的敌意。
肿瘤细胞的糖酵解代谢使环境低氧、酸性、低营养，容易产生氧化应激。在炎症环境中，肿瘤细胞通常会上调配体，如PD-L1和Galectin-9。肿瘤微环境还依赖肿瘤相关成纤维细胞(CAF)和抑制性免疫细胞等基质细胞，包括髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、肿瘤相关中性粒细胞(TANS)、肥大细胞和调节性T细胞(Tregs)。这些细胞和肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)和转化生长因子(TransformingGrowthfactorβ，TGF-β)等可溶性因子，导致肿瘤血管畸形，促进TAMS等免疫细胞的抗炎极化，并与EMT有关。它们还产生活性氧(Ros)和诸如乳酸、吲哚胺2，3-双加氧酶(Ido)、前列腺素e2(PGE2)、可溶性脂肪酸和腺苷等分子，它们有助于抑制T细胞的免疫应答。
当CAR-T激活后，从氧化磷酸化发生糖酵解，以促进更快增殖，而记忆T细胞和调节性T细胞在活化时依赖于氧化磷酸化和脂肪酸氧化（FAO）。然而，这两种代谢资源都是有限的，因为葡萄糖被肿瘤细胞耗尽，导致糖酵解T细胞营养被剥夺。缺乏葡萄糖会导致Akt/mtor信号降低、葡萄糖受体谷蛋白1下调和糖酵解能力降低。TME极限氧化磷酸化中的低氧浓度也是。总体上，这导致T细胞营养素的两个主要来源的显着耗尽。
TME中的低氧状态给记忆性T细胞提供了特殊的挑战，这些细胞的代谢严重依赖于氧。最近，一些研究开始识别和测试对CAR-T细胞的修饰，以改善其在低氧条件下的功能。Kawalekar等人发现BBζCAR-T细胞比28ζCAR-T细胞具有更高的线粒体呼吸能力(SRC)，即使在缺乏营养、缺氧的条件下(如TME)，也能提高代谢效率。由于BBζ共刺激参与了促进记忆相关代谢途径，如脂肪酸氧化和增加持久性，这些T细胞中观察到的SRC增加是为了帮助他们在低氧条件下生存。
旨在保护T细胞免受氧化应激的一种方法是设计一种CAR-T细胞共同表达过氧化氢酶，这种酶可以将过氧化氢还原成水和氧气。作者在体外对CEA和HER2CAR-T细胞进行了检测，发现与单纯CAR相比，此CAR-T具有较低的氧化状态，并具有较好的增殖和细胞毒性。
另一项研究利用与TME相关的低氧，开发出一种共同表达HIF1α的氧敏感结构域的CAR，这是一种在缺氧后稳定的转录因子。在体外，该策略使CAR在正常氧水平下的表达非常低，但在低氧条件下与HIF1α一起增加了CAR的表达水平。虽然这种方法并没有解决低氧或低氧的有害影响，但它确实为一种新型的安全开关提供了概念证明，该开关利用低氧疗法取得了治疗上的优势。
对抗肿瘤微环境中的免疫检查点
对抗T细胞衰竭最流行和最成功的策略之一是使用检查点抑制剂，针对PD-L 1(Atezolizumab)、PD-1(pbrobrolizumab、nivolumab)和CTLA-4(Ipilimumab)的药物已经单独使用，并与CART细胞治疗相结合，在许多患者中取得了成功。
在临床前，结合CAR-T和检查点阻断抗体已经显示出有希望的结果。CAR-T细胞本身也被设计成分泌检查点抑制剂抗体。在人CCRCC小鼠模型中，分泌抗PD-L1抗体的抗CAIX CAR-T细胞与标准的CAR-T细胞相比表现出明显的提高活性，增加了细胞因子的产生和免疫细胞的吸收，并显着地缩小了肿瘤的大小。在另一项研究中，一种设计用于构成性分泌抗PD-1的CAR19T细胞在CD19肺癌异种移植模型中也显示出更强的抗肿瘤活性，其T细胞增殖和细胞毒性增强，存活时间延长。
在许多临床前研究中，IRs的显性阴性基因也被成功地引入到CAR-T细胞中，例如mesothelin CAR-T细胞(CD 28或4-1BB共刺激结构域)过度表达显性阴性PD-1。以PD-1CARs为主，观察肿瘤清除情况，重复剂量PD-1阻断抗体联合mesothelin-28ζ或mesothelin-BBζCAR均能阻止肿瘤生长，但不能根除肿瘤。近年来，CRISPR/Cas 9技术已被广泛应用于CD19-BBζt细胞的PD-1和LAG-3基因敲除。在这两种情况下，利用IR基因敲除的CAR-T细胞在小鼠异种移植模型中均根除了肿瘤。PD-1基因敲除进入临床I期(NCT03298828).
克服其他肿瘤微环境抑制因素
在临床前和临床试验中，应用细胞因子来极化肿瘤环境，使其对T细胞更具吸引力，改善CAR-T细胞的吸收和功能。局部注射IL-12可诱导炎症免疫细胞的聚集，增强过继转移的抗VEGFR-2 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并导致五种不同皮下肿瘤类型小鼠的长期存活。在本研究中，联合应用IL-12+VEGFR 2的CAR-T细胞，但两者均不能单独降低VEGFR 2阳性的瘤内MDSCs，为IL-12与CAR-T细胞的联合应用提供了有力的支持。由于这样的阳性反应，已经建立了CAR-T细胞来增强T细胞的浸润和在实体肿瘤中的功能。CART细胞能够分泌细胞因子，称为“armored” CARs。特别是，细胞因子IL-12一直是这方面的一个有吸引力的工具。在小鼠异种卵巢癌移植模型中，MUC16 CAR/IL-12T细胞延长了存活时间，并显示出更强的持久性和肿瘤细胞毒性。
其他促进TME细胞功能的策略包括抑制诸如腺苷、IDO 1和VEGF等抑制性可溶性因子，以及保护TME中的非肿瘤细胞(如MDSCs、TAMS和基质细胞)免受免疫抑制。在一项在同基因肿瘤模型中使用HER2 CAR-T细胞的研究中，阻断腺苷2a受体通过增强激活和促进细胞因子的产生，显着提高了CAR-T细胞的疗效。此外，作者还报道了PD-1的阻断进一步增强了T细胞的免疫应答.另一项研究表明，阻断IDO1(与结肠癌患者生存呈负相关)与EGFRvIII CART细胞转移相结合，可显着减缓异种移植结肠癌模型中的肿瘤生长。VEGF阻断治疗黑色素瘤等实体瘤已取得成功，VEGF靶向CARs在多种临床前实体瘤模型中显示出疗效。
增加抗肿瘤策略也可包括耗尽抗炎细胞或在其他免疫抑制细胞，诱导炎症表型。对小鼠乳腺癌模型的研究表明，靶向TAMs可能对治疗进展性癌症有效，因为TAMs与更多的抗炎活性和肿瘤免疫逃避有关。
在卵巢癌的皮下小鼠模型中，HER2 CAR-T细胞的肿瘤排斥反应要求基质细胞上存在M1(炎性)巨噬细胞和干扰素γ受体，这表明T细胞，甚至功能性细胞的肿瘤特异性攻击可能不足以清除肿瘤；基质细胞靶向(例如用FAP CARS)和招募其他类型的炎症免疫细胞可能是必要的。
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