【论着】| 癌相关纤维细胞介导直肠相关作用的机制研究

［摘要］  背景与目的：结直肠癌（结直肠癌，CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤之一，但其产生的仍然是警报。肿瘤微环境（肿瘤微环境，TME），尤其是其中与癌症相关的纤维细胞（癌相关成纤维细胞，CAF），在肿瘤的发生、发展及其过程中都发挥着重要作用。本研究旨在探讨CAF（炎性CAF，iCAF）对CRC细胞的影响方法：提取自上海中医药大学附属普陀医院（2022年8月——2022年9月）诊治的CRC患者并经手术切除的CRC组织原代CAF［获得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准，编号：PTEC-A-2023-5（S）-1]，按照CAF的表面标志物第一源性生长因子受体α（血小板衍生生长因子受体α，PDGFRA）对原代细胞进行分选，筛选出iCAF。使用不添加血清的培养基分别对人培养成纤维细胞（人肠成纤维细胞，HIF）和iCAF进行培养以获取HIF条件培养基（HIF-conditionedmedium，HIF） -CM）和iCAF条件培养基（iCAF-conditionedmedium，iCAF-CM）。 根据处理方式将二氧化碳分为头痛（不处理）、实验组1（加入HIF-CM）和实验组2（加入）观察HIF或iCAF刺激后CRC细胞的死亡率变化、蛋白水平、mRNA水平变化及对Wnt/β-catenin信号转导的影响。结果：经过iCAF刺激后，CRC细胞的半数抑制浓度（半数抑制浓度，IC50）较大幅度降低和HIF-CM组升高（P＜0.05）。与高精度和HIF-CM组相比，iCAF-CM组肿瘤细胞的荧光表达率明显下降，荧光蛋白caspase-3的表达量下降，抗荧光蛋白Bcl-2、Bcl-xL和survivin表达量均上升（P＜0.05）。iCAF-CM组Wnt/β-结论： iCAF可以介导CRC细胞产生组件，其与激活机制β-catenin信号转导已有关。

［关键词］结直肠癌；炎症相关纤维细胞；添加；Wnt/β-catenin信号转导通道

［摘要］背景与目的：结直肠癌（CRC）是常见的恶性肿瘤之一，但其产生耐药性的机制尚不清楚。肿瘤微环境（TME），特别是癌相关成纤维细胞（CAF），在肿瘤的发生、发展和耐药过程中发挥着重要作用。本研究旨在探讨炎症性癌相关成纤维细胞（iCAF）对CRC细胞耐药的影响及其可能机制。方法：采集2022年8月至2022年9月在上海中医药大学普陀医院接受手术的结直肠癌患者的原代CAF，根据CAF表面标志物进行原代细胞分选［经普陀区伦理委员会批准］上海中医药大学附属医院：PTEC-A-2023-5(S)-1]，血小板衍生生长因子受体α（PDGFRA），筛选iCAF。使用无血清培养基培养人肠成纤维细胞（HIF）和iCAF细胞以获得条件培养基。根据处理方法将结肠癌细胞分为对照组（不处理）、实验组1（用HIF-CM处理）和实验组2（用iCAF-CM处理）。我们观察CRC细胞存活率和凋亡率的变化，结果： iCAFs刺激后，CRC细胞的半数抑制浓度（IC50）高于对照组和HIF-CM组（P＜0.05）。与对照组和HIF-CM组相比,iCAF-CM组肿瘤细胞凋亡率显着降低,caspase-3表达减少,Bcl-2、Bcl-xL、survivin表达增加( P＜0.05）。iCAF-CM组Wnt/β-catenin信号通路被激活。结论： iCAFs能够介导CRC细胞耐药，其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

［关键词］结直肠癌；炎性癌症相关成纤维细胞；耐药性; Wnt/β-连环蛋白信号通路

直结肠癌（结直肠癌，CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤^［1］。尽管针对癌症进展的新药不断得到巩固，但性问题仍然是该领域的一个挑战^［2］。近年来，肿瘤微环境（肿瘤微环境，TME）在化疗中的重要性已广受关注^［3］。癌症相关成纤维（细胞癌相关成纤维细胞，CAF）是TME的主要成分，其细胞因子、趋化因子组成CAF具有异质性，分成肌纤维CAF（肌成纤维细胞CAF，myCAF）、炎症CAF（炎症CAF，iCAF）并提示呈CAF（抗原提呈CAF，apCAF）^［4］。CAF继承了独特的细胞状态和多种介导机制的肿瘤促功能，成为分析TME在化疗中发挥中作用的重要靶点^［5］。iCAF作为CAF的细胞亚型，通过产生细胞因子等物质参与的肿瘤环境过程^［6］。然而，iCAF对CRC相关的影响尚待确定。本研究以iCAF无血清培养抚育iCAF如何进行免疫调节因子，再以iCAF条件培养基（iCAF条件培养基，iCAF-CM）刺激CRC细胞，探讨iCAF与CRC细胞的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人导管癌RKO细胞、HCT116细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库，人肠成纤维细胞（人肠成纤维细胞，HIF）购自美国ScienCell Research，CRC组织来源的CAF是从患者CRC（于2022年8月—2022年9月在上海中医药大学附属普陀医院经手术切除）的癌组织中分离得到的。细胞培养条件为37℃、CO ₂体积分数为5%。组织标本的使用均征得患者知情同意。本研究获得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准［伦理批件编号：PTEC-A-2023-5（S）-1］。

1.1.2 试剂

DMEM培养基、RPMI-1640培养基、双抗、胰酶均购自美国Gibco公司，上样缓冲液、RIPA溶液液均购自美国CST公司，细胞计数试剂盒-8（cellcountingkit-8， CCK-8）购自日本同仁化学研究所；Annexin Ⅴ-EGFP/PI细胞消毒检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，TritonX-100、4',6-二脒基-2-十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠，SDS）、十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠，SDS）、免疫染色固定液、细胞核蛋白抽提试剂盒均购自上海碧云天公司，实时荧光定量聚合酶链反应（实时荧光定量聚合酶链反应，RTFQ-PCR）试剂​​盒购自美国EZBioscience公司。

1.1.3 仪器

酶标仪、PCR仪均购自美国Thermo Fisher公司，玻璃偏振仪购自美国Bio-Rad公司，集中小组购自德国Zeiss公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

分别用RPMI-1640和DMEM培养基［加入100 U/L青霉素+链霉素，10%胎牛血清（胎牛血清，FBS）］对冻存的HCT116、RKO和HIF细胞进行复苏，以1× 10 ⁵个/cm ²进行培养，找到细胞培养箱中（37℃、CO ₂体积分数为5%）。待细胞数量长至对数期时，进行传代。 

1.2.2 提取原代CAF

取新鲜患者CRC组织标本，采用组织块培养法分离培养CAF。

1.2.3 免疫荧光

CAF（2×10 ⁴）在显微镜玻片上培养过夜。用PBS洗涤2次，甲醇固定15 min，0.2% TritonX-100渗透5 min，在接下来使用5%牛血清白蛋白（牛血清白蛋白， BSA）封闭1 h后，4 ℃下一步［FAP（1∶100盐水，兔源）、径向源性生长因子受体α（血小板源性生长因子受体α，PDGFRA）（1∶500盐水，兔源） ）］温育过夜，然后与二抗［山羊抗兔IgGH&L（AlexaFluor®488）］和［山羊抗兔IgGH&L（AlexaFluor®594）］温育2 h。用DAPI进行核定位评估。

1.2.4 筛选iCAF并获得iCAF-CM

从参考文献^［7］可知，PDGFRA是iCAF的标志物，因此本研究采用PDGFRA作为筛选iCAF的标志物，通过免疫荧光，从CAF中筛选出高表达PDGFRA的CAF，即为iCAF。

1.2.5获得条件培养基

另外培养HIF和iCAF，当细胞生长至80%时，将细胞培养基更换为净化FBS的培养基。处理48小时后，收集悬液作为条件培养基。高速离心后收集条件培养基，用0.22 μm微孔膜过滤，于-20℃冰箱保存。

1.2.6 实验包

将肿瘤细胞分成对照组（仅加入培养基）、实验组1［加入HIF条件培养基（HIF-conditionedmedium，HIF-CM）］和实验组2（加入iCAF-CM）。每组均设置HCT116和RKO两种肿瘤细胞。

1.2.7 CCK-8法检测细胞肿瘤率

以2×10 ⁴个/孔分别指定HCT116和RKO细胞到96孔板中培养24 h，然后分别使用奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）和5-FU药物作用24 h，以每孔100 μL CCK -8溶液加入孔中，培养温育30分钟，于450 nm波长处检测吸光度（D）值。实验重复3次，取主机。

1.2.8 流式细胞术检测肿瘤肿瘤率

各组中的1/2半数抑制浓度（半数抑制浓度，IC ₅₀）作为荧光染料的药物浓度，制剂选择24 h后，使用Annexin Ⅴ/PI双染法检测细胞，根据两个种染料不同的激发波长，分别使用流式细胞仪所带的异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC）和PE通道对样品进行检验。

1.2.9 蛋白质印迹法（Western blot）检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin蛋白水平

分别用HIF-CM和iCAF-CM对肿瘤细胞进行刺激。48小时后，用朝鲜IC50浓度的OXA和5-FU分别对肿瘤细胞进行处理。24小时后，PBS冲洗且在冰上通道后， 4℃超速离心，提取上清液，定量。沸腾水中煮5分钟，经SDS-酰胺酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE）凝胶分离，转移到聚偏二氟乙烯（聚偏二氟乙烯， PVDF）膜上，在5%脱脂奶粉中封闭1.5 h后加入一抗鼠抗β-actin（1∶5 000）、兔抗caspase-3（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶5 000） 1 000）、兔抗Bcl-xL（1∶1 000）、兔抗survivin（1∶500）于4 ℃摇床温育过夜，用含吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（tris-buffered saline Tween） ，TBST）漂洗后，加入辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶，HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（免疫球蛋白G，IgG）（1∶20 000）和山羊抗兔IgG（1∶20 000） ）之前温育1 h，另外用TBST漂洗，采用电化学发光（ECL）法，在微波成像系统中曝光检测，用Image J软件对Western blot结果进行定量分析。

1.2.10 利用RTFQ-PCR法检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表达水平

透析液中细胞后，使用快速RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，然后用RTFQ-PCR检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表达，满足条件为：95℃预变性5min进入循环，95℃变性45s，54℃退火45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸5min，以β-actin为内参基因。用2- ^ΔΔ Ct法计算目的基因的表达量，Δ Ct = Ct_目的基因－Ct _内参基因。引物设计时，β-actin的上游引物序列为5'-CCC AGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，下游引物序列为5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG CGA -3' ；Caspase -3的上游引物序列为5'-CCAAAGATCATACATGGAAGCG-3'，下游引物序列为5'-CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG-3'；Bcl -2的上游引物序列为5'-GACTTCGCCGAGATG TCCAG-3'，下游引物序列为5'-GAACT CAAAGAAGGCCACAATC-3'；Bcl-xL的上游引物序列为5'-GCATATCAGAGCTTT GAACAGG-3'，下游引物序列为5'-GAAGGAGAAAAAGGC CACAATG-3'；Survivin的上游引物序列为5'-CCGCATCTTCTACATTCAAGAAC-3'，下游引物序列为5'-CTCCTTGAAGCAGAAGAAACAC-3'。 

1.2.11通过Western blot观察iCAF对Wnt/β-catenin信号转导的影响

采用条件培养基和磁场IC ₅₀浓度的OXA和5-FU处理细胞，使用细胞核蛋白抽提试剂盒提取核内蛋白。采用We​​stern blot检测肿瘤细胞总蛋白的表达水平以及细胞核中β-catenin和Lamin B1蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理

数据用GraphPad Prism 7和SPSS 25.0软件进行统计分析。实验结果用x±s表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey's多重比较检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1代CAF提取及亚原型鉴定

首先利用CRC组织标本提取原代CAF，对细胞株命名为CAF-71和CAF-95。镜下观察其形态呈长梭形（图1）。提取的原代细胞表达CAF常见表面标志物FAP和PDGFRA，表明提取的原代细胞是成纤维细胞，其中CAF-95对PDGFRA高表达，为iCAF，因此采用CAF-95细胞进行培养并获得条件培养基（95-CM），便于后续实验的进行。

图1 原代CAF验证及筛选

图1 初级CAF验证和筛选

2.2 CRC细胞的IC ₅₀升高

随着OXA和5-FU药物浓度的上升，HCT116细胞和RKO细胞的死亡率不断下降。结果显示，HCT116中，素描OXA的IC 50_为10.701 4 μmol/L，HIF-CM组OXA的IC ₅₀为12.972 2 μmol/L，95-CM组OXA的IC50为30.380 4 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.000 1）；RKO细胞中，素描OXA的IC50为29.785 5 μmol/L，HIF -CM组OXA的IC ₅₀为32.536 8 μmol/L，95-CM组OXA的IC ₅₀为55.690 8 μmol/L，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）。HCT116细胞中，中部5-FU的IC ₅₀为87.531 2 μmol/L，HIF-CM组5-FU的IC ₅₀为86.861 9 μmol/L，95-CM组5-FU的IC ₅₀为135.781 0 μmol/L，差异具有统计学意义（P＜0.01）；RKO细胞中，化妆品5-FU的IC ₅₀为18.235 5 μmol/L，HIF-CM组5-FU的IC ₅₀为21.732 0 μmol/L，95-CM组5-FU的IC 50为21.732 0 μmol/L ₅₀为36.817 9 μmol/L，差异有统计学意义（P ＜0.001，图2）。95-CM培养后，HCT116和RKO细胞对OXA和5-FU的IC50明显升高，发病率升高，说明经iCAF刺激后，CRC细胞可能产生了产品。

图2 CCK-8检测加入95-CM对照细胞的肿瘤发生率变化

图2 CCK-8检测经95-CM处理或未经95-CM处理的肿瘤细胞的细胞活力

**：P＜0.01，与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比；***：P＜0.001，与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比；****：与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比，P ＜0.000 1。

2.3 iCAF 抑制 CRC 细胞

两种杏仁在两种抗肿瘤药物的各自作用下，首先出现在模具和HIF-CM组中，95-CM组中的细胞水平明显下降（图3）。

为了验证以上结果，我们进一步检测了iCAF刺激的肿瘤细胞中的大豆蛋白与抗大豆蛋白的表达水平变化（图4）。与心脏和HIF-CM组相比，95-CM组中，图片凋亡蛋白caspase-3的表达水平明显下降，而抗表达蛋白Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表达水平均有所上升（P  ＜0.05）。采用RTFQ-PCR检测多种蛋白的mRNA所得结果与Western blot一致，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。上述结果说明经iCAF刺激后，肿瘤细胞的筛查，充分证明iCAF能够介导CRC细胞导入。

图3 流式细胞术检测加入95-CM对照肿瘤细胞的水平变化

图3 流式细胞术检测经或未经95-CM处理的肿瘤细胞凋亡率

**：P＜0.01，与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比；***：与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比，P ＜0.001。

图4 Western blot检测β-actin、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表达

图4 Western blot检测β-actin、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL、survivin表达情况

图5 RTFQ-PCR检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA水平

图5 RTFQ-PCR检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin mRNA表达情况

**：P＜0.01，与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比；***：P＜0.001，与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比；****：与对照组(Ctrl)和HIF-CM组相比，P ＜0.000 1。

2.4 iCAF激活Wnt/β-catenin信号转导支持

本研究进一步探索了Wnt/β-catenin信号转导的变化。结果显示，3组肿瘤细胞内β-catenin蛋白的表达水平相比较，总蛋白未见明显差异，核内蛋白表达产生明显差异（P＜0.05，图6）。从上图中可以看出，95-CM组中，β-catenin发生转移，在β-catenin总蛋白不变的情况下，细胞核中的β-catenin增多，说明经iCAF刺激后，Wnt/β-catenin信号转导被激活，从而导致CRC细胞的产生。

图6 经95-CM刺激后CRC细胞内Wnt/β-catenin信号转导载体的表达变化

图6 95-CM刺激CRC细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化

3 讨论

CRC发病率在恶性肿瘤中重高居第3位，病死率高居第2位^［8］。

近来，TME在肿瘤中的作用逐渐引起人们重视并被广泛研究^［9］。其中，CAF是TME的重要组成部分，在肿瘤中发挥重要作用［10］ 。CAF可以通过多种方式发挥重要作用^［10］ 。途径介导肿瘤细胞成分^［11］：①抑制肿瘤细胞窗口；②肿瘤细胞外基质；③促进细胞上皮间质转化（上皮间质转化，EMT）；④免疫驱动抑制；⑤增强肿瘤利用；⑥ 调控肿瘤干细胞。

本研究通过免疫荧光，从原代CAF中筛选出iCAF即CAF-95后，使用95-CM刺激CRC细胞，运用CCK-8法检测到经刺激后，CRC细胞抗癌药物OXA作用的死亡率本研究进一步发现，经CAF-95刺激后，抗氧化剂caspase-3及其mRNA的水平明显上升，抗氧化剂Bcl-2、Bcl-xL和survivin及其mRNA的水平均出现上升，确认iCAF能够促进CRC引入。

Wnt/β-catenin信号转导染料对细胞的肿瘤荧光有一定作用，同时也参与EMT的过程。有研究［^12］发现，CAF激活Wnt/β-catenin信号转导染料，通过荧光细胞因子转导调节1和含F框WD重复域蛋白7阻滞线粒体，增强CRC细胞抗癌剂5-FU的增强性。另外有研究［^13］发现，与对照组相比，CAF上清液培养的肺癌E-诱导表达蛋白的表达水平邻近，且CAF的CXCL12可以激活肿瘤细胞中的CXCR4/Wnt/β-catenin信号转导诱导EMT，导致顺铂抗性增强。

Wnt/β-catenin信号转导在多种肿瘤中均被高度激活，有许多对癌症具有潜在治疗效果的Wnt信号转导互补药物的研究激发［14］^。有研究^［15］显示，Wnt/β-catenin信号转导在CRC间质的CAF中高表达。我们因此推测iCAF介导CRC细胞可能与Wnt/β-catenin信号转导完全有关。本研究通过Western blot对95- CM刺激下的CRC细胞内β-catenin表达进行检测，观察到细胞质中β-catenin减少，细胞进入核增加，Wnt/β-catenin信号转导不能被激活，参与了整个过程。

本研究仍存在一定的局限性。首先，CAF具有异质性，不同表型具有不同的功能，本研究仅研究iCAF对CRC的影响，但CAF的其他表型（如myCAF）也是否具备同样具备其次，本研究论证了iCAF通过激活Wnt/β-catenin信号转导恭促进一系列的圣诞老人的变化，从而介导CRC以此，研究还不够深入，具体机制待探索。之后的研究可重点放在Wnt/β-catenin信号转导如何参与这一过程，如发现可能的结合位点和转运蛋白上。另外，Wnt信号转导与癌症发生密切相关，但既往研究^［14］表明，Bublic Wnt信号往往会伴随着不良反应的发生，如组织破坏和再生等。

综上所述，iCAF可能是通过Wnt/β-catenin信号转导阻断肿瘤细胞的炎症，并促进细胞的EMT过程，进而诱导CRC细胞参与。因此未来将iCAF视作设计抗癌药物的潜在靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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