Cell Stem Cell：张毅组发现体细胞核移植中新的表观遗传障碍——季维智院士、刘真研究员点评
2018-07-20 赛小记 BioArt
体细胞核移植技术是现今唯一能产生全能性胚胎的技术，也是哺乳动物克隆所使用的主要技术，因此一直备受科学领域和医学界关注。哺乳动物细胞的体细胞核移植技术，是指把终末分化的体细胞核，注射到去核的卵子细胞里，从而把体细胞重编成全能型的胚胎。在过去几十年的时间里，这项技术相继在多类哺乳动物中实现突破，包括今年上海中科院神经所孙强组报道的第一例非人灵长类动物食蟹猴的克隆。但核移植胚胎和正常体外受精胚胎相比，发
体细胞核移植技术是现今唯一能产生全能性胚胎的技术，也是哺乳动物克隆所使用的主要技术，因此一直备受科学领域和医学界关注。哺乳动物细胞的体细胞核移植技术，是指把终末分化的体细胞核，注射到去核的卵子细胞里，从而把体细胞重编成全能型的胚胎。在过去几十年的时间里，这项技术相继在多类哺乳动物中实现突破，包括今年上海中科院神经所孙强组报道的第一例非人灵长类动物食蟹猴的克隆。但核移植胚胎和正常体外受精胚胎相比，发育成功率极低。以小鼠为例，仅有30%左右的核移植胚胎能成功发育到囊胚阶段，最后存活的成体克隆比例只有1%，然而，这些成功克隆的胚胎，也存在发育异常的胎盘和脐带。
因此，科学家们一直致力于寻找提高克隆效率的方法，通过研究重编程过程中的障碍，来帮助打破重编程壁垒。例如，日本RIKEN 研究所Ogura组发现核移植胚胎会出现Xist的异常表达，引起核移植胚胎X染色体的异常失活，从而造成植入后胚胎发育的缺陷。利用Xist基因敲除的体细胞作为供体细胞，克隆成体率能提高8-10倍。前些年，来自哈佛医学院的张毅研究组和同济大学的高绍荣组，都通过对核移植胚胎重编程过程的机制研究，鉴定到了重编程过程中重要的组蛋白修饰壁垒H3K9me3。来自小鼠供体体细胞的H3K9me3修饰，由于不完全的擦除，会阻碍核移植胚胎合子基因的激活， 从而使核移植胚胎发育阻滞在着床前阶段。过表达H3K9me3特异的去甲基化酶Kdm4d，能把核移植胚胎发育的囊胚率提高到几乎和体外受精（In vitro fertilization）同样的水平（大于90%）。这也是今年克隆猴中使用的关键技术之一。但是，即使如此大幅度提高了核移植技术的囊胚率，小鼠最终的成体出生率也只有大约10%。这预示着，除了H3K9me3，还有其他的障碍，抑制了胚胎着床后胚胎的发育，而这可能是导致克隆成体存活率低的关键因素。
目前鉴定到的SCNT重编程过程中的障碍。图片引自Yi Zhang et al.，Cell Stem Cell，2018（review）
近日，哈佛医学院张毅组（张毅实验室过去的博后、现为浙江大学生命科学研究院PI沈立博士为该文的共同通讯作者）在Cell Stem Cell上发表了题为Loss of H3K27me3 Imprinting in Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos Disrupts Post-Implantation Development 的文章，发现了核移植胚胎印迹基因的异常调控模式，为研究着床后胚胎的异常发育提供了新的思路。
基因印迹是指来源于父母本的两个等位基因出现了差异表达，仿佛是带上了可供识别的印迹。目前最熟悉的基因印迹调控模式是依赖于两个等位基因调控元件的DNA甲基化差异实现的。去年，张毅组发现哺乳动物中依赖H3K27me3调控的基因印迹（张毅组Nature揭示基因印迹的新机制。母本的特异H3k27me3修饰会被遗传给下一代，特异性地抑制母源基因的表达。几乎所有的H3k27me3印迹基因，在着床后的胚胎组织中都会被擦除，但在胚外组织（extra-embryonic tissue）中，部分基因的H3k27me3印迹会被保留下来。张毅组最新的这篇文章，着重研究了小鼠核移植胚胎中的印迹基因的重编程状态。
文章首先结合过表达Kdm4d和Xist的免疫荧光，证明了核移植胚胎异常表达的Xist和H3k9me3重编程缺陷，是克隆胚胎发育的两个相互独立的壁垒。单独注射Kdm4d可以把成体存活率从2%提高到9%，联合使用Xist 基因敲除后，可以再提高到20%。
紧接着，为了研究还可能存在的壁垒，研究人员利用全基因组甲基化测序方法去寻找核移植胚胎的DNA甲基化异常。但核移植与体外受精的囊胚时期的胚胎全基因组甲基化程度相似。更进一步的研究发现，核移植胚胎低甲基化的区域，主要是体外受精卵从卵母细胞中遗传下来的基因区的甲基化，核移植胚胎高甲基化的区域，主要是配子发育相关基因的启动子和增强子。并没有发现和胚胎发育基因直接相关的甲基化异常。并且已知受到DNA甲基化调控的印迹基因在核移植的胚胎里面，DNA甲基化印迹和表达都被正常保留下来。
最后，当分析印迹基因表达的时候，研究人员发现部分在正常胚胎中父本特异表达的基因，出现了两个等位基因同时表达的模式，因为这些基因在供体体细胞中，并没有像卵一样的母本H3K27me3印迹。
Sfmbt2 基因在SCNT中两个等位基因表达水平相似，并且缺少母本的H3K27me3
这项研究试图寻找更多未知的阻碍克隆效率的重编程壁垒，并发现了供体体细胞的H3K27me3基因印迹的缺失。但是这些缺少基因印迹后出现异常表达的基因，会对胚胎发育造成什么样的影响？H3K27me3调控的基因印迹是否是核移植胚胎发育障碍的原因，能够帮助成体存活率提高多少？如果存在这样的障碍，如何在等位基因水平上特异地打破这一障碍，实现运用？我们期待更多的研究来回答这些问题。
值得一提的，在上述Cell Stem Cell发表的同时，张毅教授与目前已回到日本理化学研究所（RIKEN）的Shogo Matoba发表了题为Somatic Cell Nuclear Transfer Reprogramming：Mechanisms and Applications的重量级综述论文，全面而系统地总结了体细胞核移植胚胎发育过程中分子机理研究，特别是表观遗传障碍相关的分子机理，并对体细胞核移植技术将来在生殖以及治疗性克隆方面的应用进行了探讨。此外，还对当前体细胞核移植技术中没有解决的表观遗传障碍提供了潜在可行的解决方案，这对今后进一步优化克隆体系给出了重要的参考。该文深度结合体细胞核移植技术与表观遗传进行总结并提出建设性的观点意见，是十分难得的精品综述类文章，值得用心品读和回味。
专家点评
季维智（中科院院士，昆明理工大学特聘教授、灵长类转化医学研究院院长，云南中科灵长类生物医学重点实验室理事长）
Comments：体细胞核移植（SCNT）颠覆了传统发育生物学认为哺乳类只有受精卵才具有全能性（totipotency）的概念，体细胞克隆也具有全能性，能形成生命个体。自1997年“多莉”羊被报道以后，已有多种哺乳动物克隆成功。然而，极低的克隆效率（约1%-2%的克隆胚胎最终可以发育为个体），使得体细胞克隆技术并没有有效地应用于畜牧业和濒危动物的保育及临床研究中。20余年，不少实验室努力探索相关机理。近年来，表观遗传学、干细胞生物学的理论和研究技术的长足进步，大大促进了人们对体细胞核移植机理的认识。
哈佛大学张毅教授实验室最早报道了供体细胞的H3K9me3和Xist基因的活化是克隆胚的表观遗传障碍而影响再程序化过程。在过表达H3K9me3特异去甲基化酶kdm4d后大大提高了小鼠克隆胚的发育率（Motaba et al.， 2014）。这一研究成果促进了对灵长类动物克隆的突破，自“多莉”羊后，时隔20年后克隆猴“中中”和“华华”的诞生（Liu， et al.， 2018）。
如今，张毅实验室在其前期研究的基础上，通过基因敲除供体细胞中Xist基因，结合注射kdm4d降低了克隆胚胎基因组H3K9me3的水平，从而大幅提升了植入前克隆胚胎的囊胚发育率，并且获得了20%以上的出生率，这对于提高克隆效率意义重大。然而，作者发现植入后有大部分胚胎还是逐渐停止了发育，胎盘等胚外组织仍然出现了过度发育等缺陷。通过深入对比分析克隆胚胎和IVF胚胎的转录组、甲基化谱、染色质免疫共沉淀等数据，逐步锁定引起克隆胚胎发育异常的原因与母源H3K27me3印记基因的印记缺失有关。张毅团队在克隆技术改进和探索导致克隆胚胎异常发育的原因方面又迈进了一步，这对于体细胞重编程研究和降低克隆胚胎畸形发生率，进一步拓展克隆技术的应用意义重大。
Motaba和张毅教授同期在Cell Stem Cell上发表的综述系统地梳理了诱导多能干细胞及体细胞核移植胚胎发育过程中的表观遗传障碍及已有的解决办法，这对进一步理解克隆胚胎发育异常的分子机理，优化克隆体系提供了重要参考。总之，体细胞克隆，特别是结合基因编辑技术的治疗性克隆是未来治疗一些退行性疾病的新希望。但是，这需要我们对体细胞克隆再程序化的深入理解（干细胞多能性机制的研究将大大促进相关认识）。犹如干细胞、基因编辑的临床应用一样，人们需要建立合适的动物模型，尤其是与人类遗传背景高度相似的灵长类动物模型，对安全性和有效性充分评价后，将基因编辑技术、多能干细胞与克隆技术应用于临床转化。
Comments：体细胞克隆效率低下一直是影响该技术广泛应用的一大障碍。随着技术的发展及对重编程过程理解的逐步深入，科学家们利用小鼠作为动物模型，发现了多种可以提升体细胞克隆效率的方法。比较经典的效率提升方法有：日本理化研究所Wakayama实验室报道的组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理（从~0.4%提升到~6.5%）；日本东京大学Ogura实验室报道的Xist基因敲除或敲低（从1.5%提升到14.4%）；中国科学院李劲松实验室报道的滋养外胚层替换（从2.7%提升到15.7%）；哈佛医学院张毅实验室和同济大学高绍荣实验室分别报道的组蛋白去甲基化酶Kdm4d（从1.0%提升到8.7%）和Kdm4b+Kdm5b（从1.0%提升到11.1%）组合使用。
跟正常受精胚胎相对，小鼠体细胞克隆胚胎的发育及出生效率仍然较低。如何进一步提升小鼠体细胞克隆的效率？应该不难想到的便是将以上几种方法组合使用。此篇文章中张毅实验室便是将组蛋白去甲基化酶Kdm4d和Xist敲除组合使用。他们首先确认二者提升小鼠体细胞克隆效率的机制是不同的，进而通过组合使用两种方法，克服了两种影响体细胞克隆的障碍，最终将小鼠体细胞克隆效率最高提升到了23.5%。尽管如此，他们发现克隆胚胎着床后仍然有相当比例存在异常现象，通过进一步利用DNA甲基化组、等位基因转录组、Chip-seq等对比分析正常胚胎和克隆胚胎，他们推测H3K27me3依赖的印记基因异常可能是影响体细胞克隆胚胎正常发育的另外关键因素。
然而非常遗憾的是，文章中并没有报道纠正H3K27me3依赖的异常印记基因并进一步提升体细胞克隆小鼠效率的方法。我们猜测通过体细胞水平过表达H3K27特异的甲基化酶或利用dCas9融合H3K27甲基化酶来调控印记基因可能是一个思路，但是要实现特异的调控H3K27me3依赖的母源印记基因，难度非常大。
基于小鼠体细胞重编程的研究为其他哺乳动物体细胞克隆提供了很好的参考借鉴。然而值得提出的是，由于物种的差异性，并不是所有在小鼠上可行的方法在其他物种就一定可行。另外不同细胞类型在不同物种的体细胞克隆中效率也有明显不同。参考小鼠的经验，结合多种高通量分析方法，找到最适合某一物种的方法，是其他哺乳动物体细胞克隆效率提升的研究方向。
原始出处：
Shogo Matoba, Huihan Wang, Lan Jiang,et al. Loss of H3K27me3 Imprinting in Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos Disrupts Post-Implantation Development.Cell Stem Cell.DOI: https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.06.008
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