血清外泌体检测结直肠癌患者K-Ras基因突变
2017-07-05 徐建明教授 肿瘤医学论坛
徐建明教授，解放军第307医院消化肿瘤内科主任、全军肿瘤中心副主任，中国生物医学工程协会靶向药物治疗专委会副主任委员。长期从事肿瘤患者的诊治，坚持推行个体化治疗。2003年至今，利用国际多中心新药临床试验的机会，先后使1000多例患者免费享受到国际最新药物治疗。坚持开展技术创新，在国际上首次提出EGFR靶向药物维持治疗的理论。参与国家多项肿瘤诊疗规范的起草制定。承担国际多中心新药临床研究40余
徐建明教授，解放军第307医院消化肿瘤内科主任、全军肿瘤中心副主任，中国生物医学工程协会靶向药物治疗专委会副主任委员。长期从事肿瘤患者的诊治，坚持推行个体化治疗。2003年至今，利用国际多中心新药临床试验的机会，先后使1000多例患者免费享受到国际最新药物治疗。坚持开展技术创新，在国际上首次提出EGFR靶向药物维持治疗的理论。参与国家多项肿瘤诊疗规范的起草制定。承担国际多中心新药临床研究40余项。
结直肠癌（CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，据美国预防服务特别工作组（USPSTF）最新统计，是男性第2位、女性第3位致死性癌症，死亡人数>60万/年。我国CRC的发病率与死亡率也逐年上升，且呈年轻化趋势。靶向表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂？西妥昔单抗和帕尼单抗的出现，丰富和发展了CRC的综合治疗。但是并不是所有患者均可从靶向治疗中受益，西妥昔单抗的疗效受到Ras基因状态的影响，因此靶向治疗前与治疗过程中的Ras基因检测十分重要。对于转移性CRC患者，肿瘤组织取材主要依赖结肠镜或穿刺活检的组织学检查。然而受活检取材量的限制，很难准确反映体内肿瘤基因突变状态。近年来，基于液态活检技术的发展，不断提示以外周血检测肿瘤相关突变的可行性研究成为热点。我们前期研究中，探讨了外泌体及外泌体DNA在不同条件下的稳定性，使外泌体与ctDNA、CRC等其他血液成分相比，更有优势成为癌症诊断和预后的生物标记物。本研究尝试以外泌体替代肿瘤组织检测肿瘤相关基因的突变。据报道，Ras基因最常见的突变发生在Ｋ？Ras基因12密码子（85%～95%），因此本研究以其为目的片段进行突变检测。
外泌体是一种30～150nm的双层膜囊泡，广泛分布存在于各种体液，如血液、唾液、尿液及胸腹水等。作为一类重要的细胞间通讯分子，外泌体含有丰富的蛋白质、脂类以及多种核酸，且内含物与来源细胞具有一致性。在肿瘤领域，对外泌体的研究主要集中在外泌体蛋白质及RNA在肿瘤转移中的机制，少有外泌体DNA突变的研究，外泌体DNA突变检测代替组织的研究则未见报道。
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资料与方法
一般资料
收集2014年5月至2015年9月解放军第307医院消化肿瘤内科接受治疗，经病理组织学确诊为局部晚期或转移性CRC患者的外周血标本共90例，其中男性53例，女性37例，年龄范围25～88岁，中位年龄58.0岁；肿瘤部位：左半结肠65例，右半结肠23例，全结肠2例；既往手术史：根治术59例，姑息术6例，未行手术25例；转移器官：无转移19例，1个27例，≥2个44例；治疗方案：单纯化疗80例，化疗联合西妥昔单抗10例。90例均行临床组织学Ｋ？Ras基因检测，共检出32例突变，其中G12D突变31例，G12V突变1例。
样本收集与处理
收集患者化疗后外周血样本。采集患者清晨空腹外周静脉血，使用高速离心机在5720r/min条件下，离心15min，分别收集上层血清与下层血细胞，-80℃保存，用于后续外泌体及DNA的提取。
统计学分析
采用SPSS20.0版软件进行处理。数据以百分比表示，计量资料组间比较采用t检验，一致性分析采用Kappa检验，2×2表格采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
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结果
外泌体的WesternblottinG鉴定结果
与血清及外泌体相比，去外泌体上清中的CD63和TSG101蛋白水平明显降低，而血清及外泌体中两种蛋白水平却无明显的差异，同时，Albumin蛋白水平在血清及去外泌体上清中也无明显差异。见图1。
高通量测序及外泌体K-Ras
基因突变判定结果高通量测序结果显示，目的片段的平均测序深度为388×，总Reads为78842618，Q20值（测序错误率<1%的碱基数量百分比）与Q30值（测序错误率<0.1%的碱基数量百分比）分别为98.2%与94.9%。经与参考碱基序列（K-Ras基因第2外显子）对比，分析参考基因每个位点上的碱基比例。
根据文献报道通过SNP分析判定突变情况，设定突变等位基因（MAF）的cut off值为1%，当同时满足Reads>500时，即认为存在单碱基突变。在90例CRC患者中，外泌体K-Ras基因12密码子突变共检出43例，突变率为47.7%。检出4种突变类型，其中42例突变类型为G12D，碱基变化为GGT>GAT；1例突变类型为G12V，碱基变化为GGT>GTT；1例G12D合并G12A突变，1例G12D合并G12S突变。
K-Ras基因突变频率在血细胞与外泌体中的比较
对比分析90例CRC患者外泌体DNA与血细胞DNA中K-Ras基因12密码子的突变频率。血细胞DNA的突变频率<1%，外泌体DNA的突变频率明显高于血细胞DNA（Ｐ<0.05）。显然这种差异不是由正常细胞分泌的外泌体引起，然而肿瘤细胞是能够活跃分泌外泌体的，因此，我们认为肿瘤细胞分泌的外泌体携带DNA引起了这种差异，对外泌体中DNA的基因突变检测可以反映肿瘤组织的突变情况。见图2。
外泌体与组织学的K-Ras基因突变检测
组织学的突变检测是临床检测的金标准，为探索组织学的突变检测是否能被外泌体DNA检测所代替，本研究采用ROC曲线分析外泌体与组织学DNA的K-Ras基因12密码子突变检测结果，发现曲线下面积为0.783，面积的标准误为0.051，外泌体DNA用于检测K-Ras基因12密码子突变效果具有统计学意义，外泌体DNA中突变频率越大，组织学检测中为突变型的可能性越大。当诊断界点为1%的时候，此时为最佳诊断界点。一致性分析结果显示，外泌体DNA中，K-Ras基因12密码子突变检测灵敏度为90.6%（32例突变患者中检出29例），特异度为75.9%，与组织学检测一致性为81.1%。因此认为外泌体DNA与组织学两种方法检测K-Ras基因突变具有良好的一致性。K-Ras基因4种突变型（G12D、G12V、G12D合并G12A、G12D合并G12S）在组织学与外泌体DNA检测中的差异无统计学意义（Ｐ>0.05）。见表1、表2。
组织学与外泌体中K-Ras基因12密码子突变与临床病理特征的关系
在组织学与外泌体DNA的检测中，K-Ras基因12密码子的突变与年龄、性别、肿瘤部位无关（Ｐ>0.05），与肿瘤器官转移相关（Ｐ<0.05）。见表3。
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讨论
K-Ras是表皮生长因子受体（EGFR）信号转导通路的重要调控基因，K-Ras基因突变后，无需接受EGFR信号，能够自动启动下游信号的转导，导致该信号通路异常活化，从而对EGFR单抗治疗无效。《NCCI结直肠癌临床实践指南2017》中明确指出，Ras基因突变的患者不建议使用EGFR单抗治疗。此外，即使Ras野生型患者在使用EGFR单抗治疗过程中，也会逐渐出现耐药突变，导致疾病的进展。因此Ras基因监测十分必要。
目前临床 Ras 基因检测中依靠的主要是传统的肿瘤组织检测，取材主要为术后的石蜡包埋的组织或结肠镜检查活检，由于肿瘤异质性的存在，这样的组织学检测往往是局部的，不能反映肿瘤组织的多样性。 另外，组织学检测作为一种侵入性、有创性的检查，不能根据患者的病情需求，实时进行肿瘤的监测。 因此，新的肿瘤检测方法是临床诊疗迫切需求的，血液学的肿瘤检测也成为目前研究的热点。 许多研究把血液中的游离肿瘤细胞、核酸以及蛋白质作为目标生物标志物，然而由于血液中存在丰富的酶，使得这类游离标志物极易被降解，且含量极少，增加了样本获取的难度，不能成为理想的标志物 。肿瘤外泌体作为一种双层膜的胞外囊泡，富含于血液中，取材简便，并且能够稳定保存其丰富的内含物，以其为标志物，对 Ras 基因进行检测成为一种理想的选择。
本研究显示，外泌体DNA突变检测较组织学检测灵敏度为90.6%，一致性为81.1%。结合临床资料分析，发现14例仅在外泌体DNA中检测到K-Ras基因突变的患者中，6例使用靶向EGFR单抗治疗，均存在不同程度疾病进展。上述情况说明，依靠以往的肿瘤组织检测K-Ras，有一定的局限性。一方面可能是肿瘤异质性对组织学检测的影响，局部肿瘤组织的K-Ras基因突变检测，并不能完全正确的指导临床用药。另一方面是肿瘤治疗过程中，继发突变不能及时的检测到。进一步分析发现，3例仅在组织学检测中发现K-Ras基因突变的病例，均为术后1个月的外周血外泌体K-Ras检测，考虑肿瘤切除后，患者体内肿瘤负荷减小，外周血中肿瘤外泌体含量减少，无法被检出，导致阴性的检测结果。结合具体临床病例，我们认为对外泌体中K-Ras基因的突变检测较组织学检测更为准确，尤其是针对晚期或转移性CRC患者，指导临床EGFR靶向药物的使用更加有意义。
综上所述，K-Ras基因突变与CRC发生、发展及预后密切相关，通过对CRC患者外泌体中DNA的K-Ras基因突变检测可有效反映肿瘤的突变情况，并且外泌体作为一种取材简便、含量丰富的生物标志物，肿瘤外泌体的基因检测，可实现肿瘤的实时监测，在临床应用中具有巨大的潜在价值。
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