刘正教授：MRD检测在结直肠癌诊治中的应用现状

编者按：结直肠癌（CRC）是我国发病率和死亡率最高的癌症之一，手术切除仍是I-III期结直肠癌最主要的治疗手段。循环肿瘤DNA（ctDNA）是目前公认检测术后微小残留病变（MRD）的有力工具，MRD与复发和预后密切相关。本期，【医悦汇】特邀中国医学科学院肿瘤医院刘正教授分享MRD检测在结直肠癌诊疗中的现状，以供交流。

正文如下

结直肠癌已经成为全球第三大高发癌症和第四大常见癌症死因，严重威胁着患者的生命健康。临床对结直肠癌的认知在经历数十年发展后渐趋完善，但结直肠癌患者的复发监测和预防仍是诊治过程中的重点与难点。微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）检测提供了一种精准的、非侵入的方法，和传统的检查手段形成很好的互补，因而越来越受到关注。本文对近年来结直肠癌领域有关MRD的相关研究进行综述，希望能够为结直肠癌的临床诊治提供更多的参考。

目前，结直肠癌(colorectal cancer，CRC) 在全球癌症发病率中位居第三，死亡率为第四位，在我国，近几十年来其发病率与死亡率逐渐上升。在目前的CRC诊疗过程中，复发转移是患者死亡的主要原因。尽管在临床中对高危患者采取标准的辅助治疗，但在高风险IIIC期的CRC患者中5年生存率仍仅有53%。如果能够早期预测复发和转移，并且及时采取干预措施，将能够有望提高CRC患者的生存率。近年来微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）越来越受到业内的关注，MRD是指肿瘤经过治疗后由传统影像学或实验室检查不能发现，但体内仍然存在与原始肿瘤细胞具有相似表型和遗传特征的肿瘤状态，被认为是引发肿瘤复发的重要因素和判断预后的重要指标。

MRD的检测主要是通过血液循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）实现的，近年来这项技术已成为结直肠癌诊疗中的重要手段，为早期判断预后、监测复发、疗效评估及指导用药提供有效依据，在肿瘤精准医疗中的价值日益突出。在CRC的治疗过程中，如果能够实现精准监测MRD，将会提早发现癌症复发有助于指导进一步调整辅助治疗方案。

1 结直肠癌MRD检测的优势

传统检查，包括病理活检、影像学以及生化指标，在CRC的发生、发展的监测及治疗过程中有着重要意义，组织活检更是包括CRC在内的恶性实体肿瘤诊断、分期和治疗决策的“金标准”。然而肿瘤组织活检仅能提供单一时间节点和病灶区域的静态信息，不能全面展示分子改变的时间和空间异质性。此外，组织活检常常涉及侵入性操作，对患者存在潜在风险，包括出血、感染及病变播散等。

MRD检测的优势包括，首先，得益于其非侵入性的特点，方便重复取样，这使得治疗过程中通过连续取样检测肿瘤特征，实现实时监测成为可能，同时还能克服肿瘤空间异质性，可相对全面实时地反映肿瘤分子特征。一项研究发现，晚期实体肿瘤患者的循环游离 DNA（circulating free DNA，cfDNA）和患者原发肿瘤组织DNA 的高通量测序（NGS）显示，在肿瘤组织样本中检测到的突变与外周循环样本的吻合度为70%。

另外，相较于传统检测方法，MRD检测具有敏感性和时间优越性。一项研究表明，CRC术后血浆的ctDNA分析预测癌症复发的敏感度为100%，且CRC术后复发的患者，ctDNA阳性和影像学复发之间的中位时间为9.4个月，而癌胚抗原（CEA）升高和影像学复发之间的中位时间为3.3个月，二者比较有统计学差异，ctDNA在早期反映癌症复发方面更具优势。而且，常用来作为CRC危险程度分层的标准血清CEA水平不能预测复发，相比之下液体活检缩短了临床诊断复发的间隔时间，争取了CRC复发前的治疗优势。

2 基于ctDNA的MRD检测

ctDNA是由肿瘤细胞代谢分泌、凋亡或坏死过程中释放入外周血的DNA片段。ctDNA携带了其衍生肿瘤细胞的特异性遗传学特征，自从1977年的研究证实肿瘤患者的血浆游离DNA比正常人更高且在化疗后会明显降低后，许多研究表明肿瘤患者和健康者的血浆ctDNA水平存在差异，这为肿瘤早期诊断、预测疗效和预后以及监测MRD和复发打下了坚实基础。

ctDNA仅占外周血总游离DNA的一小部分，但随着二代测序技术（NGS）的发展，已经可以满足肿瘤生物学相关的检测。在近期一项随机对照试验中，关于ctDNA分析用于II期结肠癌患者术后治疗方案决策的结果显示，对于罹患II期结肠癌的患者，ctDNA指导组的患者术后辅助化疗比例低于标准管理组(15% vs 28%；RR，1.82），且不影响患者无复发生存时间（RFS）。

ctDNA相较于CEA、CA19-9等传统肿瘤标志物和CTC更适合作为结直肠癌MRD的筛查工具。与CEA与CA19-9等相比，ctDNA的血浆半衰期极短 （一般<2 h），因此在手术切除后若无肿瘤残留可迅速逆转为阴性，比CEA和CA19-9等更早、更准确地检测出复发的CRC病灶。与液体活检中另一生物标志物CTC相比，ctDNA诊断患者MRD的敏感性（79%）较CTC的敏感性（62%）更高，另一项研究则表示外周血中检测到ctDNA时可能检测不到CTC，而能检测到CTC时一定可以检测到ctDNA。由此可见，ctDNA是一种较好的癌症复发检测指标。此外，在术后诊疗过程中联合使用检测方法，如 ctDNA 与 CEA、ctDNA与CTC及多时间节点ctDNA联合分析，均可使复发检测的敏感性和特异性提高，以更精确地指导后续治疗。

另一方面，术后ctDNA阳性与肿瘤复发有相关关系。一项研究表明，未接受辅助治疗的Ⅱ期CRC患者术后4-10周ctDNA检测到的MRD预示着最终的肿瘤复发，RFS显著降低（HR，18；95%CI[7.9-40]），且有极高的特异性。有多项研究证实，CRC患者在手术联合辅助治疗后，ctDNA阳性与疾病复发也呈强相关性，术后的ctDNA检测结果能作为预后预测依据。值得注意的是，ctDNA-MRD检测阴性结果还为低风险患者提供了降低治疗强度的可能，即部分MRD阴性患者可以不接受术后辅助治疗，对提高患者生存质量具有重要意义。

在ctDNA的各项检测方法中，甲基化检测优于定量检测和特异突变检测。ctDNA的甲基化异常在CRC中相当常见，包括经典的抑癌基因失活。与特异突变相比，CRC中存在更多甲基化异常的区域，在提高MRD检测的灵敏度方面显示出了巨大潜力。

3 结直肠癌MRD检测的局限性

目前MRD若要在CRC诊疗临床实践中应用，仍存在许多挑战。例如克隆性造血（clonal hematopoiesis ，CH），对cfDNA的全基因组阵列分析表明，大多数cfDNA是来自造血细胞的，这表明来自造血细胞的基因组突变也可能从血浆中检测到，CH是ctDNA检测中假阳性的常见原因。从癌症患者中检测到的高达50%的cfDNA突变和从健康对照组中检测到的80%的突变具有与CH一致的特征，例如在CRC发生过程中起到关键作用的突变基因TP53，这些突变可能会被误判，导致样本中CH突变的检测可以被解释为肿瘤切除后MRD的表现。针对这一问题，现有研究提出对外周循环中的有核白细胞做深度测序（deep NGS）以识别CH突变，并将这些突变从样本中排除。虽然该技术方法可行且操作简单，但成本较高。

此外，尽管飞速发展的NGS技术极大提高了CRC低频突变（低至0．01%）的检出率，但由于肿瘤病理部位、组织类型、肿瘤负荷、分期等因素可影响ctDNA的产生，检测敏感度不足和“非脱落”肿瘤（non-shedding tumor）也是影响ctDNA检出的因素，因此假阴性目前仍是限制MRD检测敏感度的重要原因。

除检测敏感度外，术后采血时间也影响了基于ctDNA的MRD检测。因为细胞损伤，术后血浆的cfDNA大量增加，从而稀释ctDNA。有研究表明，结肠直肠癌术后4周内cfDNA水平持续上升，而4周后在血浆样本中ctDNA的检出率更高[34]。另一项研究证明，术后检测ctDNA-MRD应该在术后至少1周进行，对于愈合时间较长的手术，可能需要2周甚至更长时间。为了对晚期癌症基因进行分型，在无进展肿瘤或积极治疗有效的肿瘤中应避免采血，以尽量减少假阴性结果[34]。其他如正常细胞的胚系变异、cfDNA的肿瘤来源、药物治疗和多种生理病理因素对ctDNA检测的影响均是亟待解决的问题。

另外，某些常见液体活检标志物如循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC），尚因为在外周血中的效度太低而难以实际应用，在未来或许有望用于CRC的MRD检测。

尽管结直肠癌的MRD检测仍面临许多挑战，但已经展现出了巨大的应用前景，其具有纵向监测分子突变的优势，可以作为传统组织病理学检查和影像学的良好补充，进而完善CRC的精确肿瘤学研究和个体化治疗。

4 总结与展望

随着精准医学和个体化治疗的进步，MRD检测在结直肠癌临床工作中的应用越来越广泛，不仅使得结直肠癌预后监测更实时便捷，而且还可作为传统检测的互补。MRD检测在探索治疗耐药性和预测肿瘤预后等方面优于传统的检查方法，而且可以实现实时全面地反映肿瘤的分子特征，从而达到精准医疗与个体化治疗的目标。然而目前还未有标准化的检测方案与国际化的共识指南，在实际临床工作中应用MRD仍面临诸多挑战。但随着研究的不断深入，MRD检测必将成为在结直肠癌诊治中指导临床决策并改善预后的崭新道路。