林奇样综合征NGS和IHC方法检测的结果存在不一致，如何理解?

在患MMR缺陷肿瘤的疑似林奇（Lynch）综合征患者中，高达70%的患者在MMR基因中缺乏可识别的胚系致病性变异，这被称为林奇样（Lynch-like）综合征（LLS）。之前的研究已经报道了多种LLS相关肿瘤中双等位基因体细胞MMR失活。此外，将肿瘤检测结果转化为患者管理仍有争议。本研究旨在评估常规工作流程中实施肿瘤MMR基因检测所面临的挑战。研究者描述了229例LLS患者的临床特征。对39个可获得的肿瘤进行了MMR基因检测，采用两个变异丰度（VAF）阈值（≥5%和≥10%）对结果进行分析。

VAF≥5%时发现的双等位基因体细胞事件多于VAF≥10%时（35.9% vs. 25.6%），免疫组化结果不一致的发生率增加（30.8% vs. 20.5%）。在疑似LS病例的诊断算法中，目前识别MMR体细胞打击的效用存在解读困难。

研究背景

林奇综合征（LS）约占结直肠癌（CRC）病例的3%，也易发生子宫内膜、卵巢和其他肿瘤。LS是由错配修复（MMR）基因（MLH1、MSH2、MSH6或PMS2）之一的胚系失活或EPCAM基因缺失引起，其分子诊断主要依赖于肿瘤MMR缺陷（MMRd）筛查（微卫星不稳定性[MSI]评估和/或MMR免疫组织化学[IHC]染色）以及胚系MMR检测。在患有与MMR基因体系甲基化不相关的MMRd肿瘤的患者中，多达70%的患者缺乏可识别的胚系致病性变异（PV）。这些病例被称为林奇样综合征（LLS）。最近的研究报告，在15%-95%的LLS肿瘤中发生MMR基因的体细胞双等位基因失活，可能代表散发性事件。此外，MUTYH或MSH3的胚系双等位基因失活，或POLD1和POLE基因的外切酶结构域内的胚系PVs可导致MMRd。

LLS的临床管理具有挑战性，因为它们代表了一组异质的遗传性和散发性疾病。与LS个体相比，LLS亲属患CRC的风险较低，但高于散发病例。本研究对LLS队列进行了临床和分子特征分析，并对可获得肿瘤的患者进行了肿瘤检测。本研究旨在评估在常规基因检测流程中实施肿瘤分析的可行性，以改善LLS患者的诊断和管理。

患者和方法

完整的临床队列包括229例LLS病例（52.4%的男性和47.6%的女性）：105例之前报告的和124例新发现的肿瘤中有MMRd和/或MSI的患者，但没有胚系MMR PVs，也没有MLH1启动子的体细胞超甲基化。临床及肿瘤数据见表1。

表1

在229例LLS患者中，41例肿瘤细胞占比>70%的肿瘤样本进行了分子检测，并符合以下纳入标准：（1）MSI和/或MMRd肿瘤；（2）MLH1、MSH2、MSH6、PMS2或EPCAM中未发现胚系（可能的）PVs，这些PVs是根据其IHC MMR表达模式进行测序的；（3）无体细胞MLH1启动子超甲基化。使用适用于体细胞检测的NGS panel对从结直肠癌或子宫内膜癌中提取的DNA进行分析。在VAFs≥5%且覆盖频率≥30X的编码区和相邻内含子区（即±20 bp）中发现的所有变异均来自以下基因：MLH1(NM_000249.3)、MLH3(NM_001040108.1)、MSH2(NM_000251.1)、MSH3(NM_002439.3)、MSH6(NM_000179.2)、MUTYH(NM_001128425.1)、PMS2(NM_000535.5)、POLD1(NM_001256849.1)和POLE(NM_006231.2)。变异分类使用了vaRHC，这是一个根据ACMG/AMP ClinGen基因特异性指南开发的半自动变异解读工具。在可能的情况下，研究者通过比较配对肿瘤DNA中胚系杂合SNP（单核苷酸变异）的等位基因分数来评估杂合性缺失（LOH）。如果肿瘤组织中至少有3个构成性杂合SNPs显示等位基因不平衡，则认为LOH状态为阳性。在VAFs≥20%的肿瘤中发现的变异通过Sanger测序在血液来源的DNA中重新检测，以按照建议丢弃之前遗漏的组成性变异。

研究结果和讨论

本临床系列包括229例LLS个体。34.9%的个体有LS相关肿瘤家族史，发生LS相关肿瘤的年龄与家族史无相关性。首次诊断癌症的平均年龄为53.9岁（范围：16-85岁）。大多数女性被诊断患有CRC（90.8%），主要发生在近端结肠（58.9%），19.3%的女性还被诊断患有子宫内膜癌，5.7%被诊断患有与LS相关的其他肿瘤（卵巢癌、胃癌、小肠癌和尿路上皮癌）。MMRd的IHC模式与其他已发表的结果一致，其中很大一部分显示缺乏MLH1‐PMS2表达（59.5%）和MSH2‐MSH6表达（25.4%）。表1总结了人口统计学、肿瘤和分子数据。

在41例LLS肿瘤中，有2例（4.9%）因DNA扩增失败而被排除。当VAF阈值≥5%时，39例患者中有14例（35.9%）检测到与IHC模式一致的双重体细胞打击，其中10/14例（71.4%）检测到2个体细胞MMR PVs，4/14例（28.6%）检测到1个体细胞MMR PV和同一MMR基因的LOH（杂合性缺失）。此外，一些患者存在影响同一MMR基因的两次以上体细胞打击（病例5、104、208）。此外，在11/39例（28.2%）样本中，检测到符合肿瘤MMR免疫组织化学模式的一个体细胞打击。由于缺乏可提供信息的SNPs（单核苷酸变异），其中9例不能评估LOH，因为NGS前的基因检测算法只针对1或2个MMR基因。12/39（30.8%）的病例发现与免疫组织化学模式不一致的体细胞打击。此外，具有一个相容体细胞打击的4例患者在其他MMR基因中携带额外的体细胞 PVs，这与肿瘤MMR IHC模式不一致，因此导致解读困难（病例45、61、78、194）（图1A）。

图1

为了解决解读结果不明确并且由于缺乏正交验证，研究者将VAF检测阈值提高至≥10%，以减少潜在的假阳性信号和乘客突变，这些突变是MSI的影响，而不是其原因。通过这一调整，根据IHC MMR状态，39例患者中有10例（25.6%）发生了兼容的双重体细胞打击（相比之下，之前为35.9%）。不一致结果的发生率也显著下降（30.8%降至20.5%）。然而，无体细胞打击的患者数量增加（5.1%增至28.2%）（图1A-C）。

在POLE、POLD1、MSH3或MUTYH等可能导致MMRd的其他基因中未发现PVs。

在报告的双等位基因MMR失活百分比中，存在广泛的异质性，这可以部分归因于实验设计和数据分析的差异，因此难以进行无偏倚比较。此外，体细胞分析的解释所带来的局限性也尚未得到明确的描述。考虑到MMRd肿瘤的高突变性，可能会出现不明确的解读，这证明了制定标准化方案的必要性。本研究表明，单个肿瘤可能存在涉及不同MMR基因的多个打击。此外，在30.8%（VAF≥5%）或20.5%（VAF≥10%）的病例中，主要的MMR打击与IHC模式不一致。这些案例被认为是不确定的。

病例198说明了本研究的一个显著发现（图2A）。常规肿瘤筛查发现PMS2表达缺失（图2B），提示仅PMS2胚系突变分析。然而，MLH1 c.113A>G; p.(Asn38Ser) PV在肿瘤DNA中被检测到，VAF=59.1%，并随后在血液DNA中得到证实（图2C），因此患者198被重新分类为LS。这一发现凸显了之前的基因检测策略的缺点之一，即根据IHC模式靶向候选MMR基因。最近，NGS技术的出现使得在大多数诊断流程中实施了多基因panel，从而可以同时分析疑似LS患者的所有MMR基因。然而，由于存在高度同源的假基因，使用基于NGS的方法分析PMS2在诊断环境中仍然存在挑战。

图2

配对体细胞-胚系检测已被反复建议作为一种有用的方法，通过识别引起LS的胚系PVs以及LLS肿瘤的双等位基因MMR体细胞突变来提高诊断率。此外，配对分析可以简化对MMR变异的解读，特别是那些在低VAF检测到的变异。尽管MMR基因的嵌合突变似乎罕见，但该策略也具有检测体细胞嵌合的潜力。

正如本研究所示，对LLS患者肿瘤分析的解读有时存在争议。通过使用本研究的方法，双体细胞MMR失活只能解释研究系列中最多1/3的MMRd肿瘤。此外，对于未发现双等位基因MMR变异的LLS患者是否应按照LS进行治疗，还是应根据个人史和家族史进行治疗，目前尚未达成共识。在多基因检测时代，如果获得的结果不能提供信息，则可以大概率排除胚系原因。这一事实，加上体细胞分析的解读困难，以及其对LLS患者临床管理的影响缺乏共识，提出了目前MMR体细胞打击识别在疑似LS病例常规诊断算法中的效用的疑问。在常规诊断中，研究者建议只有在验证所使用的方法显示出高信息性结果率之后，才对LLS肿瘤的MMR基因的体细胞变异进行分析。

参考文献：

Rofes, Paula et al. “Tumor analysis of MMR genes in Lynch-like syndrome: Challenges associated with results interpretation.” Cancer medicine vol. 13,7 (2024): e7041. doi:10.1002/cam4.7041