【综述】内皮细胞诱导脑动静脉畸形发生发展作用机制的研究进展

摘要:脑动静脉畸形(bAVM)是青年颅内出血的重要原因｡大量研究结果表明,内皮细胞是bAVM异常血管结构形成过程中的关键细胞｡该文通过回顾相关文献,对内皮细胞在bAVM发生､发展过程中的作用机制,以及血流动力学､炎性反应等血管微环境调控内皮细胞促进bAVM生长､破裂的相关机制进行了综述,并对bAVM的形成机制与潜在治疗方案进行了总结与展望｡

脑动静脉畸形(brain asteriovenous malformations, bAVM)是一种异常的血管缠结,其病灶由动静脉分流形成异常扩张的畸形血管团组成,bAVM 是青年颅内出血和癫痫发作的重要原因｡约95% 的bAVM为散发性,其余5%由遗传性出血性毛细血管扩张症进一步发展而来｡在遗传因素､血流动力学以及环境因素的共同刺激下,bAVM 可进一步发生血管构筑的异常重塑甚至破裂出血｡

血管内皮细胞､平滑肌细胞､周细胞等血管组分在bAVM的形成､发展中具有重要作用,其中血管内皮细胞受循环系统中氧气､细胞因子含量等直接调控,参与分子交换,调节组织微环境,维持血压以及控制血管通透性等｡血管内皮细胞稳态失调可能是bAVM形成的始动因素｡本综述重点阐述了内皮细胞在bAVM中作用的研究进展｡

1 血管内皮细胞

血管内皮细胞,简称内皮细胞,分布于整个循环系统中,通过细胞间的紧密连接和基质成分形成毛细血管､动脉和静脉的管腔｡发育过程中的动静脉分化不仅受到遗传因素调控,还与机械应力､炎性反应､代谢等信号的刺激有关｡脑血管内皮细胞特异性表达大量跨膜转运蛋白､特异性代谢基因､转录因子｡同时,单细胞转录组学研究表明,中枢神经血管系统与外周血管系统中内皮细胞具有不同的转录特征,表现出强烈的时空异质性｡内皮细胞之间通过连接蛋白形成紧密连接,与周细胞和星形胶质细胞共同参与血-脑屏障的功能维持｡与正常脑内皮细胞相比,bAVM 中的内皮细胞在形态学上呈现出不成熟的､过度活跃的表型,并且伴有丝状伪足､胞浆囊泡和空泡化的出现｡在分子水平上,与正常脑内皮细胞相比,bAVM 内皮细胞表达更高水平的促血管生成因子,因此具有更强的增殖和迁移能力,并可形成异常的管腔结构｡

2 遗传性bAVM

种系突变是在人胚胎发育期已经携带的变异,目前已确定内皮糖蛋白(endoglin,ENG)､活化素受体样激酶1和SMAD4 3个基因的失活突变可导致遗传性出血性毛细血管扩张症｡上述3 个致病基因均可调控转化生长因子β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)/骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号通路,参与血管生成的诸多环节｡敲除内皮细胞中的遗传性出血性毛细血管扩张症相关基因的啮齿动物模型常被用来研究散发性bAVM的发病机制｡

2. 1 TGF-β超家族

TGF-β是一种多功能细胞因子,属于转化生长因子超家族｡TGF-β与TGF-β超家族中的BMP组成的TGF-β / BMP信号通路在血管发育中发挥着关键作用｡ENG和活化素受体样激酶1作为TGF-β和BMP的受体,主要在内皮细胞中表达,参与胚胎血管发育中的功能分化,是调控血管内皮细胞功能分化的重要因素｡胞外配体与活化素受体样激酶1 和ENG 结合后磷酸化转录因子SMAD1､SMAD5或SMAD8,进而与SMAD4结合形成复合体,共同进入细胞核调节下游基因的表达｡另外,内皮细胞中的活化素受体样激酶1功能丧失使蛋白酪氨酸磷酸酶磷酸化减少,引起磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路增强,进而介导了内皮细胞增殖､迁移､异常血管生成等恶性表型｡

2. 2 Ras p21蛋白活化子1(Ras p21 protein activator 1 , RASA1)和B 型肝配蛋白受体4(ephrin type-B receptor 4, EPHB4)

人类全外显子组测序研究发现,促红细胞生成素生成肝癌相互作用体B2 / EPHB4 / RASA1 信号轴在脑血管发育中发挥重要作用｡RASA1 和EPHB4的遗传性功能缺失突变将导致毛细血管畸形-脑动静脉畸形(capillary malformation-asteriovenous malformation, CM-AVM) ｡在CM-AVM1 型患者中,RASA1功能的缺失引起丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号的过度激活,促进了畸形样血管的生成｡EPHB4主要表达于血管发育过程中的静脉内皮细胞,其配体促红细胞生成素生成肝癌相互作用体B2 表达于动脉内皮细胞,二者对于建立动脉和静脉内皮细胞的特性及相应的血管形成至关重要｡EPHB4 功能缺失主要发生于CM-AVM2 型患者当中｡此外,另有研究显示,某些全身单发或多发的血管病变内的促红细胞生成素生成肝癌相互作用体B2 / EPHB4 /RASA1相关突变可能反映了该通路在发病过程中的体细胞嵌合现象｡因此,该通路还可能与散发性bAVM发生相关,但还需进一步探索｡

3 散发性bAVM

大多数的bAVM为散发性,新发种系突变和体细胞突变为散发性疾病的常见病因｡

3. 1 新发种系突变

人类新发种系突变是在一代内新发生的种系突变,一般为精卵结合或受精卵发育过程中的自发突变｡有研究对60 例bAVM 患者的种系DNA 和匹配的未受影响的亲本血液样本进行了外显子测序,确定了16个与散发性bAVM相关的新发种系突变,包括ENG､内皮PAS1 蛋白､弹性蛋白微纤维接口1､连接斑珠蛋白､α1-1 型胶原基因等｡进一步的研究表明,在已知的内皮间充质转化(endothelium-mesenchymal transition, EndMT)基因列表中包含这16个基因中的3 个(即连接斑珠蛋白､ENG和α1-1型胶原基因),这表明新发种系突变可能调控bAVM中的EndMT过程｡

3. 2 体细胞突变

Nikolaev等与Hong 等的研究表明,散发性bAVM主要为Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog, KRAS)或重组人丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(B-Raf proto-oncogene,BRAF)的体细胞突变引起,并明确了MAPK通路为KRAS或BRAF激活的下游通路｡Nikolaev等首次在60%(45 / 75)的bAVM手术样本中检测到了内皮细胞特异性的KRASG12D､KRASG12V突变｡KRAS激活突变会引起相关下游信号通路过度激活,导致细胞恶性增殖｡Hong等基于脑和脊髓动静脉畸形患者的组织和血液样本进行的肿瘤特异性基因靶向测序发现,KRAS基因下游BRAF的突变同样存在于bAVM内皮细胞中,且携带KRAS 或BRAF体细胞突变的比例高达87. 1%｡然而,KRAS 突变是否是bAVM 发生机制中的必要条件仍存在争议｡有研究表明,无论是否存在KRAS突变,MAPK /细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路激活均是bAVM 形成机制中的关键性分子事件｡Park等用靶向脑内皮细胞的腺相关病毒建立了KRASG12V位点突变的bAVM小鼠模型,并使用MAPK / ERK通路的抑制剂曲美替尼进行干预后发现,曲美替尼具有一定抑制bAVM 生长的作用｡

4 bAVM的血管发育

脑血管系统具有独特的解剖结构和分子特征,其生长发育受到血管发生､生成､成熟和血管重塑相关关键分子的驱动,并随脑代谢水平而变化｡Klostranec和Krings认为,畸形血管的形成是正常血管生成的基础上所发生的功能障碍｡目前对于血管畸形发育的认识大多基于“二次打击”学说,第一次“打击”为种系突变,第二次“打击”通常为缺氧､炎性反应导致的体细胞突变｡基于此学说构建的动物模型大多用于遗传性出血性毛细血管扩张症和CM-AVM引起的bAVM 的研究｡在血管生成过程中,若突变导致尖端细胞表型增加或柄细胞表型减少,则可能出现过度出芽的血管床｡进一步研究表明,尖端细胞增加可促进散发性bAVM的进展,而柄细胞的减少通常可导致遗传性bAVM 的发生｡

5 影响内皮细胞稳态的血管生成相关通路

5. 1 Notch通路

Notch通路是介导动脉和静脉分化的关键信号通路,是决定内皮细胞分化和血管管腔形成的关键通路,其功能丧失或突变均可能导致异常的动静脉分流｡Carlson等证实,在成年小鼠中,Notch4胞内结构域的激活导致了异常的脑动静脉分流,Notch4被抑制后,该异常表型被迅速逆转｡后续在人bAVM标本中观察到了Notch4､配体重组人Jagged-1蛋白和δ样蛋白4活性均增加｡另有研究表明,Notch1的表达,而非Notch4,与bAVM的破裂有关｡

Notch通路对血流剪应力高度敏感,可将机械应力与生化信号联系起来,并参与调节血管重塑｡Karthika等研究证实,振荡剪应力刺激下的内皮细胞可发生EndMT,并且该过程需要Notch 信号通路的介导｡Notch信号通路的失调可能是bAVM中内皮细胞发生EndMT的关键分子事件｡

5. 2 Wnt通路

Wnt信号通路与胚胎血管生成密切相关｡Huo等在低血流量bAVM 组织中检测到了Wnt通路的激活,并发现内皮细胞中卷曲蛋白受体10和肌纤蛋白的过表达可以激活Wnt信号通路,以促进血管生成反应,推测该现象可能会引起畸形团的高阻力,导致低血流表型｡此外,Hermanto 等研究表明,在血管发育过程中,Wnt和Notch信号通路可发生交互,以确定适当的内皮细胞分化､血管重塑和动静脉规范｡他们还观察到,在bAVM中,Wnt通路增加了SRY-box 转录因子17 的表达,随后激活Notch通路并促进动脉样血管的成熟｡

6 bAVM中的EndMT

EndMT是指内皮细胞失去其原有特征并向间充质进行转化的过程｡Shoemaker 等首次在bAVM中观察到了EndMT｡Xu 等研究表明,体细胞KRAS突变可以诱导内皮细胞的EndMT,并在探讨KRASG12D 诱导EndMT 的具体机制时发现,KRAS 突变可通过TGF-β / BMP / SMAD4 通路激活EndMT,进一步研究发现,TGF-β / BMP / SMAD4 通路拮抗剂洛伐他汀逆转了KRASG12D诱导的EndMT｡Yao等研究表明,SRY-box转录因子2 的过表达可能是bAVM发生EndMT原因之一,并发现组蛋白去甲基化酶JMJD5是SRY-box转录因子2发挥作用的直接靶点｡通过微出血的人bAVM样本,Fu等发现,EndMT 与bAVM 微出血有关,而在bAVM 微出血过程中,SMAD6 的显著下调通过TGF-β / BMP信号通路促进了人脐静脉内皮细胞EndMT｡EndMT参与bAVM破裂的病理生理过程尚需进一步研究｡

7 血管微环境对内皮细胞的作用

7. 1 血流动力学

内皮细胞对剪应力等机械作用十分敏感,血流剪应力作为血流动力学的切向分量影响着内皮细胞中多种基因的表达｡bAVM 中动脉和静脉之间缺乏阻力血管,动静脉分流导致高剪应力直接作用于内皮细胞,对bAVM发生及破裂出血具有重要作用｡Ryu等发现,bAVM患者来源的内皮细胞在高剪应力下血管生成相关基因显著高表达｡Tu 等的研究证实,高剪应力可能通过激活Notch1和Notch4 促进血管生成和重塑｡血流动力学改变诱导bAVM发生血管重塑的具体分子机制目前尚不明确,这一研究方向或有助于阐明bAVM进一步生长或畸形组织切除后复发的原因,为bAVM复发的治疗提供新的研究思路｡

7. 2 炎性反应

在bAVM 的形成和破裂过程中均涉及炎性反应｡内皮细胞不仅是炎性分子的靶点,也可能直接诱导炎性反应｡bAVM中经炎性反应刺激的内皮细胞表达高水平的血管生成因子,如内皮素1､血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体,从而促进了bAVM的进展;bAVM 来源的内皮细胞也可分泌多种促炎和趋化因子,实现血管局部的循环性单核细胞黏附和跨血管运动,并进一步通过巨噬细胞分化加剧局部组织炎性反应,导致血管不稳定甚至破裂｡

8 总结及展望

通过基因组学､转录组学､蛋白质组学和代谢组学分别对基因､RNA､蛋白质和代谢物进行大规模的筛查,使bAVM的发病机制取得了前所未有的进展｡遗传突变､新生种系突变和体细胞突变均可能是bAVM发生的始动因素｡散发性bAVM内皮细胞中KRAS突变的发现,对bAVM 的研究产生巨大的推动作用｡在突变的基础上涉及到多种信号通路,但这些信号通路是如何导致畸形样血管生成的,是否代表了畸形血管的分子异质性和不同亚型仍有待观察｡建立更有效､可靠的bAVM临床前模型,或可有助于进一步理解基因突变､遗传学､表观遗传学和转录组学等在bAVM发展中的关联及作用。