Nature Medicine：从微生物组到癌症防治：肠道菌群与结直肠癌发展的相关性探讨

引言

随着近年来微生物组（microbiome）研究的快速发展，研究人员越来越关注肠道微生物与多种疾病之间的关系，尤其是结直肠癌（colorectal cancer，CRC）。结直肠癌是全球范围内发病率和死亡率较高的癌症之一，其发展过程中微生物因素的作用日益被重视。然而，关于微生物组在结直肠癌发展中的确切作用仍存在不少科学问题，这些问题的解答对于开发新的预防和治疗策略至关重要。

4月30日Nature Medicine上发表的研究文章“Microbiome confounders and quantitative profiling challenge predicted microbial targets in colorectal cancer development”中，深入探讨了微生物组分析在预测结直肠癌中的微生物靶点时所面临的困难和挑战。研究指出，由于存在大量的混杂因子（confounders），当前的微生物组分析方法可能难以精确预测与结直肠癌发展密切相关的微生物靶标。

该研究主要发现包括：1. 基于不同的基因组数据库和统计方法，得到的预测结果存在显著差异，这表明在微生物组数据分析中需要采取更为标准化和系统化的方法。2. 一些统计学上显著的微生物标记，并不一定与结直肠癌的临床表现直接相关，这提示需要对数据进行更深入的生物学验证。3. 研究还强调了研究设计的透明度和开放获取数据的重要性，确保能够验证和重复研究成果。

该研究的意义在于，它不仅揭示了在结直肠癌研究中采用微生物组分析所面临的科学和方法学挑战，而且也为未来的研究提供了重要的指导，特别是在如何设计研究以及如何解释微生物组数据方面。通过进一步优化分析方法和增强数据的透明度，未来有望在预防和治疗结直肠癌方面取得更显著的进展。

Highlights

深入探讨微生物组分析的挑战

该研究深入分析了在使用微生物组（microbiome）数据预测结直肠癌（colorectal cancer，CRC）相关微生物靶点时遇到的挑战。研究团队详细讨论了混杂因子（confounders）如何影响结果的准确性，特别是如何通过改进数据处理和分析方法来提高预测的可靠性。

强调数据透明和共享

文章强调了科学研究中数据透明和开放访问（open access）的重要性。研究所使用的所有数据都有详细的可访问性描述，并且确保了研究的可重复性，这对于科学界的进步至关重要。

方法学的创新与标准化

研究提出了多种改进现有微生物组分析方法的策略，包括使用标准化的数据集和统一的分析流程。这些创新不仅提升了研究的准确性，也为未来相关领域的研究提供了方法学上的参考。

增强生物统计分析的深度

本研究使用了多种先进的生物统计工具（biostatistical tools）和软件，如R包（R packages），来处理和分析复杂的微生物组数据。通过这种方式，研究能够更准确地识别出与结直肠癌发展相关的微生物标记。

提升研究设计的严谨性

文章详细报告了研究设计，包括样本收集、数据分析和结果解释的所有细节，确保了研究的透明性和严谨性。这种详尽的研究设计模式为同领域的其他研究者提供了重要的实验设计参考。

Strategies

研究设计和数据收集

本研究采用了一种综合的研究设计，首先通过收集大量的结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者和健康对照组（healthy controls）的肠道微生物样本。所有参与者都经过详细的临床评估和筛选，以确保数据的一致性和可比性。样本收集遵循了严格的医学伦理准则和程序。

微生物组数据的获取与处理

研究中使用了高通量测序技术（high-throughput sequencing）来分析肠道微生物的16S rRNA基因，这是一种常用于微生物多样性研究的方法。通过对这些数据进行严格的质量控制和预处理，包括去除低质量的序列和潜在的污染物，研究团队确保了数据的准确性和可靠性。

统计和生物信息学分析

利用多种生物统计和生物信息学工具，如R软件包（R packages）中的phyloseq、vegan、DirichletMultinomial等，研究团队对微生物组数据进行了深入分析。这包括微生物群落结构的多样性分析、微生物丰度的比较以及与结直肠癌相关性的统计检验。此外，研究还采用了贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion）来选择最佳的数学模型，用于分析微生物数据与癌症发展之间的关联。

混杂因素的识别与控制

考虑到多种潜在的混杂因素（confounders），如患者的年龄、性别、饮食习惯和生活方式等，可能影响微生物组和疾病之间的关系，研究中使用了多变量统计模型来调整这些因素的影响。通过这种方法，研究确保了发现的微生物标记与结直肠癌的关联是独立于这些混杂因素的。

Behind the Scenes

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是指发生在结肠或直肠的恶性肿瘤。结肠与直肠构成了人体的大肠部分，结直肠癌是由大肠内壁的细胞失控增长形成的。这种癌症是全球范围内常见的癌症类型之一，对男女都有较高的发病率。

在全球范围内，结直肠癌是第三常见的癌症类型，并且是导致癌症死亡的第二大原因。据世界卫生组织（WHO）的数据显示，每年约有190万新的结直肠癌病例和90万相关死亡。发病率在不同国家和地区之间存在显著差异，通常在发达国家较高，可能与生活方式、饮食习惯和遗传因素有关。

结直肠癌的主要临床表现

改变排便习惯：包括便秘、腹泻或排便习惯的其他改变。

血便：粪便中出现鲜红色或黑色的血。

腹痛：可能是间歇性或持续性的腹部不适或痛感。

体重减轻：未经试图减肥而出现的体重明显下降。

乏力：感觉异常疲倦或体力下降。

肠梗阻的症状：包括腹胀、腹痛、呕吐等。

结直肠癌的治疗方式取决于癌症的阶段、患者的整体健康状况以及癌症的具体位置。目前的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等。

手术治疗：对于大多数局部结直肠癌，手术是首选治疗方法。早期结直肠癌可能只需局部切除，而更晚期的癌症可能需要更广泛的手术，如全结肠切除。

放疗：放疗常用于直肠癌的治疗，特别是在手术前后，以减小肿瘤体积或杀死剩余的癌细胞。

化疗：化疗常用于手术前后治疗，以消除微小转移、减少复发风险或作为晚期癌症的姑息治疗。化疗药物可以口服或通过静脉注射。

靶向治疗和免疫治疗：针对特定的分子靶点的治疗，如抗EGFR（表皮生长因子受体）或抗VEGF（血管内皮生长因子）抗体，用于某些遗传性质的结直肠癌。免疫治疗也在某些具有特定生物标志的晚期癌症中显示出疗效。

治疗的难点

癌症晚期发现：许多患者在诊断时癌症已处于晚期，这时候癌细胞可能已经扩散至其他器官，治疗难度大幅增加。

复发和转移：即使初次治疗成功，结直肠癌仍有较高的复发率和转移潜力，尤其是晚期癌症。

个体差异：患者对治疗的反应存在显著差异，治疗效果因人而异，需要个体化治疗方案。

药物耐药性：随着治疗的进行，癌细胞可能发展出对化疗或靶向治疗药物的耐药性。

肠道微生物与结直肠癌

20世纪80-90年代：初步的研究开始揭示肠道微生物群与人体健康之间的关系。虽然这时的技术还不允许详尽分析微生物群落的复杂性，研究者开始注意到肠道病理状态（如炎症性肠病）与微生物失衡之间的联系。

2000年代初：随着高通量测序技术的发展，研究人员能够更详细地分析和比较健康与疾病状态下的肠道微生物群落。这些技术的进步帮助研究人员开始探索肠道微生物与结直肠癌的具体关系。

2006年：人类微生物组计划（Human Microbiome Project）的启动，标志着对人类微生物群系系统性研究的开始，为理解肠道微生物如何影响结直肠癌提供了基础数据和方法工具。

2011年：研究表明，肠道中某些特定的病原体（如Fusobacterium nucleatum）与结直肠癌的发生有关联。这是首次明确指出特定微生物与CRC发展的直接关系。

2014年及之后：研究开始揭示微生物如何通过慢性炎症、影响宿主免疫响应、以及产生致癌物质等机制促进CRC的发展。例如，研究发现肠道细菌产生的胆汁酸代谢物可能促进肠癌的发生。

近年来的发展：肠道微生物与CRC治疗效果的关系也成为研究热点，尤其是在探索微生物群落如何影响免疫治疗和化疗的效果方面。研究人员发现肠道微生物组成可以影响患者对某些癌症治疗的反应，如免疫检查点抑制剂的反应。

该研究结果显示，结直肠癌患者的肠道微生物组与健康对照组存在显著差异。特别是某些细菌属，如Fusobacterium和Peptostreptococcus，在结直肠癌患者中的丰度明显增高，这与先前的研究结果一致，进一步验证了这些微生物可能在结直肠癌的发展过程中扮演重要角色。

微生物组在结直肠癌生物标记中的应用

V4区域的选择性和重要性：16S rRNA基因是细菌和古菌（archaea）鉴定的黄金标准。V4区域因其高变异性被广泛用于微生物多样性研究和物种识别。在结直肠癌中，通过高通量测序技术，V4区域能提供足够的分辨率，识别出与健康和疾病状态相关联的细菌群体，帮助研究者理解微生物如何在肠道微环境中与宿主细胞相互作用，进而影响癌症进程。

真菌和病毒的角色：尽管细菌是研究的主要焦点，但真菌和病毒的研究近年来也逐渐增加。真菌群落的失调可能影响肠道屏障功能，激活炎症反应，从而在癌症的发展中扮演角色。病毒，尤其是某些致癌病毒（oncoviruses），已知可以直接导致细胞癌变。在结直肠癌中，研究表明某些病毒群可能通过改变宿主的免疫反应或通过影响细胞的遗传物质来促进肿瘤形成。

研究方法与挑战：通过使用现代生物信息学工具，例如Metaphlan和Kraken，研究人员能够从复杂的微生物组数据中提取有价值的信息。然而，这些研究面临的挑战包括样本处理的标准化、数据分析的复杂性以及微生物多样性内在的高度个体差异。

混杂因子的影响

混杂因子，如患者的年龄、饮食习惯、生活方式、抗生素使用历史等，都可能独立地或与微生物共同影响结直肠癌的发展。例如，年轻的结直肠癌患者可能有不同的肠道微生物组成与年长患者相比。抗生素的使用历史也能显著改变肠道微生物群，可能掩盖或模拟微生物与癌症之间的关联。此外，饮食习惯，如高纤维或高脂肪饮食，也会对肠道微生物多样性产生重要影响。

在对微生物靶点的预测中，如果不适当地控制这些混杂因子，可能会导致错误的结论。在本研究中，通过使用多变量统计模型来调整这些因素的影响，研究人员发现，初步认为与结直肠癌关联显著的某些微生物，其关联性在调整混杂因子后显著减弱。这一发现提示，在未来的微生物组研究中，考虑这些外部因素的影响是至关重要的。

这一研究揭示了在结直肠癌微生物组研究中预测微生物靶点的复杂性，强调了在进行这类研究时需要全面考虑和控制潜在的混杂因子。未来研究应进一步探索和验证具体微生物与结直肠癌之间的因果关系，以及这些关系如何受到患者生活方式和环境因素的共同影响。通过这种方法，科学家们可以更准确地识别真正的疾病生物标记（biomarkers），为结直肠癌的预防和治疗提供更为有效的靶点。

统计方法的应用和改进

为了准确识别与结直肠癌相关的微生物组成分，需要应用复杂的统计模型和生物信息学工具，这些工具能够处理和分析大规模的微生物组数据。

在该研究中，采用了Dirichlet multinomial mixtures（DM）模型和Bayesian information criterion（BIC）等高级统计方法。DM模型是一种用于分析组成数据的统计方法，尤其适用于微生物组数据，因为它可以有效处理数据中的多重共线性和非独立性问题。BIC则用于模型选择，帮助研究者确定在给定数据下哪个模型更为合适，通过比较不同模型的BIC值，选择BIC值最小的模型，以确保分析的准确性和简洁性。

在具体实施中，首先通过高通量测序技术获得肠道微生物的16S rRNA基因序列数据，然后使用QIIME 2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）等生物信息学工具进行数据的初步处理，包括去噪、序列对齐和操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）的挑选。处理后的数据输入到DM模型中，分析不同微生物在健康个体与癌症患者之间的相对丰度差异。

通过这种方法，研究发现某些特定微生物群在结直肠癌患者中的显著变化，如增多的Fusobacterium和减少的Faecalibacterium。这些结果提供了潜在的生物标记（biomarkers）用于早期诊断和治疗。此外，通过DM模型和BIC的应用，研究提高了分析的精确度，减少了假阳性的风险，使得研究结果更加可靠。

数据排除（Data exclusions）

由于微生物组数据的复杂性和内在的变异性，研究人员在统计分析中排除了那些在各诊断组中少于5%的样本中出现的、未能在物种层面（species level）分类的分类群（taxa）。这样的排除标准是基于以下几点考虑：

统计稳定性和代表性（Statistical stability and representativeness）：出现频率极低的物种往往不能稳定地代表微生物群落的常规状态，也可能是偶然的环境污染或实验误差的结果。通过设置一个阈值（5%），研究确保了所分析的数据在统计上具有足够的代表性和可靠性。

物种鉴定的准确性（Accuracy of species identification）：在物种层面未分类的微生物数据可能来源于当前分类数据库中尚未明确描述的微生物，或是由于技术限制导致的鉴定不准确。这些数据的不确定性可能对整体分析结果产生误导性影响。

生物信息学处理的标准化（Standardization of bioinformatics processing）：在生物信息学分析中，对原始序列数据进行过滤和预处理是常见的做法，以排除那些可能影响最终解读的低质量或低置信度数据。此外，使用5%的阈值可以减少计算复杂度，提高分析效率。

排除这些数据后，研究焦点将集中在那些在较大比例样本中一致出现的、分类明确的微生物上，这有助于提高对结直肠癌相关微生物标记的发现和验证的可靠性。例如，通过比较健康个体与CRC患者的微生物组成，研究可以更准确地识别出与疾病相关的关键微生物种类，进一步探讨它们在肠道健康和疾病中的潜在作用。

潜在的局限性

样本大小与统计力 (Sample Size and Statistical Power)

研究中提到，没有进行样本大小的计算，队列大小是基于以前的研究结果确定的。这可能限制了研究结果的统计有效性和推广性，因为样本大小直接影响到研究的统计功效（statistical power），从而可能导致假阴性或假阳性结果。

数据排除标准的主观性 (Subjectivity in Data Exclusion Criteria)

研究中排除了未能在物种层面分类或在每个诊断组中少于5%样本出现的分类群。这种排除标准虽然有助于减少噪音，但也可能排除了重要的生物学信息，特别是那些低丰度但生物学上重要的物种。

横断面研究设计的限制 (Limitations of Cross-pal Study Design)

由于这是一项横断面研究，无法提供因果关系的证据，只能揭示变量之间的关联。这种设计不足以确定微生物组变化是结直肠癌发展的原因还是结果。

微生物数据的复杂性和处理方法 (Complexity of Microbiome Data and Analytical Approaches)

尽管使用了高通量测序技术和复杂的生物信息学工具，微生物组数据的解析仍面临挑战，包括数据的高变异性、大量未分类的微生物以及数据处理方法的选择可能对结果产生影响。

微生物识别的局限 (Limitations in Microbial Identification)

使用16S rRNA基因测序主要限于细菌和古菌的鉴定，对于真菌和病毒等其他微生物群的分析能力有限。此外，即使是在细菌和古菌中，也存在对某些物种进行准确分类的困难。

潜在的研究方向

微生物组成分的深入分析 (In-depth Analysis of Microbiome Components)

未来的研究可以更深入地探讨不同微生物组成分在大肠癌发展中的具体作用及其机制。

长期追踪与大数据分析 (Long-term Tracking and Big Data Analysis)

可进行长期的患者追踪研究，以及使用大数据分析方法，以更全面地理解微生物组变化与大肠癌发展之间的关系。

临床应用与干预研究 (Clinical Applications and Intervention Studies)

探索基于微生物组调整的预防和干预策略（intervention strategies），评估这些策略在实际临床应用中预防大肠癌的潜力和有效性。

原文链接

Tito RY, Verbandt S, Aguirre Vazquez M, Lahti L, Verspecht C, Lloréns-Rico V, Vieira-Silva S, Arts J, Falony G, Dekker E, Reumers J, Tejpar S, Raes J. Microbiome confounders and quantitative profiling challenge predicted microbial targets in colorectal cancer development. Nat Med. 2024 Apr 30. doi: 10.1038/s41591-024-02963-2. Epub ahead of print. PMID: 38689063.

https://www.nature.com/articles/s41591-024-02963-2