长期应用NSAIDs对大鼠骨关节炎关节软骨胶原代谢的影响

【摘要】

目的 探讨长期应用塞来昔布、布洛芬、吲哚美辛对大鼠骨关节炎关节软骨胶原代谢的影响。

方法 采用左侧跟腱切除术诱发Wistar大鼠同侧膝关节骨关节炎(OA)，分为4组，每日给赛来昔布24 mg/kg (CE组)、布洛芬72 mg/kg(IBP组)、吲哚美辛9 mg/kg (IN组)及生理盐水(NS组)。观察3、6、9个月后关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的变化。

结果
(1) CE对OA软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达无明显影响；
(2) IBP可促进OA软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达，胶原合成量增加；
(3) IN可抑制Ⅱ型胶原的表达，促进OA软骨细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。

结论　长期应用CE对关节软骨胶原代谢无明显影响；IBP不仅促进软骨细胞Ⅱ胶原的表达，亦促进软骨细胞异型胶原的表达；IN可能会加剧关节软骨胶原代谢的损害。

骨关节炎(OA)是以关节软骨病理性损害为主的老年性退行性疾病，其治疗以缓解症状、减少残疾、改善关节功能和提高生活质量为主(1)。非甾体抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)是最常用的OA症状缓解药物。患者多需长期服用这类药物，易产生胃肠道并发症，如出血、溃疡、穿孔、梗阻等(2)。但其对关节软骨本身的代谢产生的影响目前研究较少。

体外研究发现，赛来昔布可促进人OA关节软骨细胞合成蛋白多糖，抑制蛋白多糖的降解，对正常关节软骨细胞无明显副作用(3,4)；吲哚美辛、布洛芬可抑制软骨基质的合成，加速软骨基质的耗竭，加重关节软骨的损害(5,6)。其长期应用的基础实验则未见报道。

本文就长期应用三种NSAIDs对实验性大鼠OA关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

健康Wistar大鼠130只，其中模型鼠10只，3～4月龄，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机分为4组：赛来昔布(Celecoxib，CE)组、布洛芬(Ibprofen，IBP)组、吲哚美辛(Indomethacin，IN)组和生理盐水(Normal saline，NS)组。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 通过手术切除跟腱致膝关节应力降低，诱发Wistar大鼠膝骨关节OA模型(7)。左膝为实验侧，右膝为对照侧。

1.2.2 给药方法 参照文献(8)方法。CE组大鼠每天给予CE 24mg/kg；IBP大鼠每天给予IBP 72 mg/kg；IN组大鼠每天给予IN 9mg/kg；NS组大鼠给予NS。若大鼠体重相差超过50g，给药个体化。每日定时给药一次，给药时间为3、6、9个月。

1.2.3 观察指标
1.2.3.1 关节软骨组织学观察 造模3、6、9个月后，颈椎脱臼法处死动物，解剖膝关节，4%多聚甲醛及70%乙醇固定，10%EDTA脱钙，石蜡包埋，切片。切片HE染色，光镜下观察关节软骨细胞、关节面、软骨基质、潮线等情况。
1.2.3.2 关节软骨蛋白多糖半定量测定 切片1%甲苯胺蓝染色，Olympus光学显微镜观察软骨基质、软骨细胞染色情况并照像，采用北航医学图像分析系统测定计算每一个视野(统计场)的阳性染色平均光密度，每个标本取5个视野。
1.2.3.3 软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原的免疫组化染色 使用购自武汉博士德生物化学技术公司的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒进行实验。Olympus光学显微镜观察软骨基质、软骨细胞染色情况并照像，采用北航医学图像分析系统测定计算每一个视野(统计场)的阳性染色平均光密度，每个标本取5个视野。阳性结果：软骨细胞胞浆中出现棕黄色着色；着色深度与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原表达强度即浓度呈正比。

1.3 统计学处理

对定量、半定量数据采用SAS6.12统计分析软件处理，以x±s表示，应用方差分析，进行多个样本均数间的两两比较，采用q检验。

2 结果

2.1 OA动物模型的观察

左膝术后2个月时出现OA早期改变，应力集中部位可见关节软骨表面轻微毛糙，软骨基质的着色发生改变，HE染色呈淡染，软骨细胞轻度增生；甲苯胺蓝染色轻度不均匀。实验中IN组大鼠死亡严重，不能完成第9个月实验。

2.2 HE染色光镜观察

造模后3、6、9个月，NS、CE组在各时期表现相似，为OA的渐进发展过程。3个月时应力集中区域表面不光滑，可见双柱状、巢状软骨细胞增生；6个月时，关节软骨表层剥脱，大量软骨细胞增生；9个月时，关节软骨表层带进一步粗糙，NS组软骨细胞有所减少，CE组无明显减少。IN组3个月时软骨层变薄，呈绒毛状外观，软骨细胞排列紊乱，有成簇现象；6个月时上述改变进一步加重，可见较多软骨细胞坏死。IBP组3、6个月改变介于二者之间，9个月时关节软骨厚度变薄、蚀损，软骨细胞排列紊乱，软骨细胞坏死、数量减少。

2.3 甲苯胺蓝染色图像分析结果

CE组较NS组在3、6个月均显著增加蛋白多糖含量(P＜0.01)；IBP组较NS组在3、6个月对蛋白多糖含量无明显影响(P＞0.05)，在9个月显著降低蛋白多糖含量(P＜0.01)；IN组较NS组在3、6个月均显著降低蛋白多糖含量(P＜0.01)。

2.4 Ⅱ型胶原表达的图像分析结果

3个月，CE组、IBP组、IN组较NS组对Ⅱ型胶原表达无显著性差异(P＞0.05)；6、9个月，IBP组较NS组显著增强Ⅱ型胶原表达(P＜0.01)。

2.5 Ⅰ型胶原表达的图像分析结果

3个月：CE组、IBP组、IN组较NS组显著增强Ⅰ型胶原表达(P＜0.01)；6个月，CE组、IBP组、IN组、NS组对Ⅰ型胶原表达无显著性差异(P＞0.05)；9个月IBP组较NS组显著降低Ⅰ型胶原表达(P＜0.01)。

2.6 Ⅲ型胶原表达的图像分析结果

3个月，CE组、IBP组、IN组较NS组对Ⅲ型胶原表达无显著性差异(P＞0.05)；6个月，IN组较NS组显著增强Ⅲ型胶原表达(P＜0.01)；9个月，IBP组较NS组显著增强Ⅲ型胶原表达(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 OA与NSAIDs

鼠OA模型病理改变、软骨生化指标与人类OA较一致，已广泛用于OA的研究(9)。我们采用切除大鼠跟腱，致同侧膝关节应力降低、关节不稳，膝关节载荷传导紊乱，引起关节软骨的退行性变，诱发膝OA，术后2个月膝关节软骨出现早期退行性改变，3、6、9个月的病理改变类似人类OA的缓慢病理发展过程(10)。关节外手术干预诱发的OA，更接近于OA的病理发展过程，宜于观察OA早期病理改变及研究药物对关节软骨代谢的影响。

免疫组化证实OA早期就有胶原的破坏。OA时胶原纤维发生紊乱和丧失，其程度与OA的病变程度一致(11,12)。关节软骨的损害首先是软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原的破坏，修复过程中，部分软骨细胞发生去分化，软骨细胞胶原表型异常，表达Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。OA的治疗以缓解关节疼痛和控制炎症为主，非甾体类抗炎药(NSAIDs)是首选药之一，其抗炎是通过抑制COX2而起作用。长期应用NSAIDs对OA关节软骨胶原的代谢的影响目前国内、外研究均很少。

3.2 NSAIDs对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

关节软骨含量最多的是Ⅱ型胶原。John等(13)发现在OA早期，Ⅱ型胶原和蛋白多糖核心蛋白的mRNA表达都明显增高。OA晚期Ⅱ型胶原的合成与降解平衡被破坏，软骨基质中Ⅱ型胶原总量明显减少。本实验中，CE在3、6、9个月对OA关节软骨细胞对Ⅱ型胶原的表达均无明显影响，在OA 治疗中，其发挥抗炎镇痛作用时，可能不会干扰关节软骨Ⅱ型胶原的代谢；IBP促进OA关节软骨细胞对Ⅱ型胶原的表达，Ⅱ型胶原合成量增加，弥补OA时Ⅱ型胶原的丢失。IN抑制软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，Ⅱ型胶原合成减少，抑制退变软骨的Ⅱ型胶原的代谢。

3.3 NSAIDs对软骨细胞Ⅰ型胶原表达的影响

OA时关节软骨胶原的改变最为复杂。体外培养的OA软骨细胞能迅速转型，从合成Ⅱ型胶原转(16)。本实验发现，OA关节软骨细胞能同时表达I、Ⅲ型胶原，Ⅰ、Ⅲ型胶原最初出现在软骨表层和中间层，逐渐出现于软骨的全层，随OA病程加剧其表达强度增加，这与OA软骨表层最早受损的病理改变相符。本实验中短、中期用药，CE在一定程度上促进软骨细胞Ⅰ型胶原表达，而IBP、IN明显促进Ⅰ型胶原的表达；长期用药CE则不影响软骨细胞Ⅰ型胶原表达，IBP反而抑制Ⅰ型胶原表达。

3.4 NSAIDs对软骨细胞Ⅲ胶原表达的影响

本实验发现，连续用药3个月，CE、IBP、IN对软骨细胞Ⅲ型胶原表达无明显影响；连续用药6个月，CE、IBP对软骨细胞Ⅲ型胶原表达仍无明显影响，而IN则明显增强软骨细胞Ⅲ型胶原表达；连续用药9个月，IBP促进软骨细胞Ⅲ型胶原表达。

CE对OA关节软骨细胞Ⅱ型胶原的表达及胶原异常表型无明显影响；IBP、IN明显促进软骨细胞胶原异常表型的变化，促进软骨细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原，改变软骨胶原纤维网架结构的成分，改变关节软骨的力学性能。但是，IBP能同时促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，增加胶原含量，从该方面考虑，似乎对软骨基质代谢有利。

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